Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
TChIP-Seq: Cellen spesifikk Epigenome profilering
Chapters
Summary January 23rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver en trinnvis protokoll for tandem chromatin immunoprecipitation sekvenser (tChIP-Seq) som gjør analysen av cellen spesifikk genomet hele histone modifisering.
Transcript
Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i epigenetikkfeltet, for eksempel hvor mye kromatiske modifikasjoner er regulert på en celletype spesifikk måte sammen med genomer. Den største fordelen med denne teknikken er at vi kan isolere kromatin fra de målrettede cellene og deretter følge typisk sigøyner nedstrøms. Så denne metoden kan gi innsikt i nevron spesifikk trimincil, lysinc 4, opisoncilly.
Det kan også brukes på andre histone modifikasjon, andre celletyper, og deretter andre modell organismer. Å demonstrere prosedyren vil være Mari Mito, en tekniker fra laboratoriet mitt. Til å begynne, bruk fin vårsaks for å dissekere vevet av interesse i små biter.
Tilsett vevsfragmentene til en ren beholder fylt med flytende nitrogen. Deretter overfører vevsfragmentene til to milliliter rør fylt med flytende nitrogen. Oppbevar rørene på minus 80 grader Celsius i fem minutter med hetten åpen for å fordampe det flytende nitrogenet.
Plasser rørene som inneholder vevsprøvene på et kjølt metallisstativ. Deretter plasserer du en metallkule i et 1,5 milliliter rør og kjøler den ned med flytende nitrogen. Plasser den avkjølte metallkulen på et av prøverørene.
Lukk hetten og sett røret inn i rørholderen på en kryogen kvern. Dypp umiddelbart den monterte rørholderen i flytende nitrogen i ett minutt. Sett den frosne rørholderen inn i den ytre kassetten på den kryogene kvernen.
Og rist den kraftig i 30 sekunder, 60 ganger. Etter dette demonterer du kryogensliperen, fjerner metallkulen. Og plasser røret i en forhåndskjølt prøvekjøler.
Oppbevar kjøleren ved negative 20 grader Celsius i 15 minutter. Deretter legger du til 900 mikroliter med 1% formaldehyd til røret og pipetten for å blande. Overfør suspensjonen til et nytt to milliliter rør med 900 mikroliter på 1% formaldehyd.
Deretter fikser du suspensjonen i 10 minutter med mild rotasjon ved 23 grader Celsius. For å stoppe fikseringsreaksjonen, legg til 100 mikroliter av 2,5 molarglysin til røret. Og sentrifuge på 3000 ganger tyngdekraften i fem minutter på fire grader Celsius.
Etter dette, kast supersupernatant. Tilsett en milliliter PBS til røret og virvelen å blande. Sentrifuge på 3000 ganger tyngdekraften i fem minutter ved fire grader Celsius.
Gjenta dette vasketrinnet, to ganger til. Deretter legger du til 500 mikroliter lysisbuffer en til pellet og pipetten for å blande. Sentrifuger røret i fem minutter ved 3000 ganger tyngdekraften ved fire grader Celsius og kast det overnaturlige.
Tilsett en milliliter lysisbuffer to til pellet og vortex å blande. Deretter sentrifuger suspensjonen i fem minutter ved 3000 ganger tyngdekraften ved fire grader Celsius og kast det overnaturlige. Etter dette, tilsett 800 mikroliter radioimmunoprecipitation analysebuffer med proteasehemmercocktail til pellet og pipette for å blande.
Sentrifuger suspensjonen i fem minutter ved 3000 ganger tyngdekraften ved fire grader Celsius og kast det overnaturlige. Deretter legger du til 500 mikroliter RIPA-buffer med proteasehemmercocktail til pelleten. Deretter sentrifuger suspensjonen i fem minutter ved 3000 ganger tyngdekraften ved fire grader Celsius og kast det overnaturlige.
Tilsett en milliliter RIPA-buffer med proteasehemmercocktail. Umiddelbart etter å ha lagt RIPA buffer med proteasehemmer cocktail, overføre lysate til en sonicator tube. Og plasser røret på en ultralydsovn.
Bruk innstillingene som er beskrevet i tekstprotokollen, skjær kromatin. Deretter overfører du prøven til et 1,5 milliliter protein lavt bindende rør. Og sentrifuge det i fem minutter på 20,000 ganger tyngdekraften på fire grader Celsius.
Samle supernatant fra prøven og overføre den til et nytt protein lav bindingsrør. I denne protokollen ble tandemkroomatin immunoprecipitation sekvensering introdusert og demonstrert. Under prosedyren ble kvaliteten på DNA testet på flere trinn.
Umiddelbart etter sonikering ble det skjærede DNA isolert og testet med mikrofluidisk elektroforesemaskin. Etter bruk av anti-FLAG antistoff og anti-H3K3me3 antistoff for å utføre affinitet rensing DNA-kvaliteten ble sjekket igjen. Spesifisiteten av immunrensing av DNA på H2B-FLAG ble bekreftet med negative kontrollprøver.
Der ubetydelige mengder DNA ble oppdaget. Videre inn i protokollen ble kvaliteten på sekvenseringsbiblioteket verifisert. Den vellykkede ChIP og T-ChIP ble dokumentert via berikelsesanalyse ved hjelp av primere rettet mot promotorregionen av GAPDH-genet.
Representative omfordelinger langs tre nevrongener ble oppnådd. Og berikelsen av lesing på de fem viktigste endene av genene av nevron T-ChIP søker over hele hjernen T-ChIP søk ble observert. Etter en stabilisering baner denne teknikken vei for forskere i det epigenetiske feltet for å utforske celletypespesifikk histonemodifisering generelt i nevroner hos mus.
Ikke glem at arbeid med formaldehyd kan være ekstremt farlig og å ta forholdsregler som bruk av gummiklær og briller bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
