Bioengineering
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Isolasjon og Decellularization av en helt svin bukspyttkjertelen
Chapters
Summary October 10th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Tissue engineering for hele bukspyttkjertelen er en utfordring på grunn av dens exocrine og endokrine funksjoner. Vi viser en metode for Disseksjon av en intakt svin bukspyttkjertelen og prosessen med vellykkede decellularization av perfusjon av vaskemidler Triton X-100, natrium deoxycholate og deoxyribonuclease.
Transcript
Denne metoden kan brukes til disseksjon av svin bukspyttkjertel som inneholder tilkobling, duodenal, og miltapper og eventuell decellularisering via perfusjon av vaskemidler ved kalde temperaturer. Selv om denne metoden for decellularisering gir innsikt i svinepanatinen, kan den også brukes på bukspyttkjertelen fra andre store dyr. Den største fordelen med denne teknikken er at den letter intakt gjenfinning av et komplisert organ, for eksempel bukspyttkjertelen, for videre vevsteknikk.
Generelt, enkeltpersoner nye til denne metoden, vil de slite fordi disseksjon av intakt bukspyttkjertel mens identifisere og ligating alle de omkringliggende blodårene krever mye praksis å mestre. Før du begynner prosedyren, bruk ett tre-til-fem-millimeter silikonrør for å koble vaskemiddelbeholderen til den peristaltiske pumpen og et annet tre-til-fem-millimeter silikonrør for å koble den peristaltiske pumpen til organkammeret via avgasseren. Koble en hann Luer til den frie enden av det andre røret, og bruk et tredje tre og fem millimeter silikonrør for å koble organkammeret til vaskemiddelsamlingsbeholderen via den peristaltiske pumpen.
Til slutt kobler du en to millimeter umerket pipette til de frie endene av rørene i vaskemiddelbeholderen og vaskemiddeloppsamlingsbeholderen. Deretter plasserer du decellulariseringsoppsettet på fire grader Celsius. For å høste bukspyttkjertelen, legg en heparinisert, 45-kilos, kvinnelig gris på et disseksjonsbord i liggende stilling, og bruk en skalpell for å lage et 40-centimeter midtlinjesnitt fra xiphoidprosessen til kjønnsbenet for å avsløre bukorganene.
Etter å ha identifisert milt, duodenal og tilkoblingsfliker, finn de store duodenale papillaene, og bruk to individuelle suturer til å muntlig ligate tolvfingertarmen fra stedet. Ligate den dårligere spiserøret med ekstra suturer, og kutt mellom ligaturene med saks for å lette fjerning av magen. Skill bindevevet fra tykktarmen for å nå tynntarmen, og skill bindevevet i tykktarmen som festes til milten i bukspyttkjertelen.
Tynntarmen er festet til bukspyttkjertelen ved bindevev ved miltenappen, men omgir også bukspyttkjertelen. Du må nøye følge tarmbanen for å detangle og skille bindevevet mellom tarmen og bukspyttkjertelen. Etter ligating arteriene, fjern tykktarmen fra tynntarmen.
Identifiser den dårligere mesenteriske venen, det dårligere mesenteriske arterietreet, og ligate karene med en sutur caudal til bukspyttkjertelen og kutt med saks. Ligate miltarterien og venen sammen i hilum, nær milten, og kutt distally med saks for å fjerne milten. Følg tolvfingertarmen til duodenal og tilkobling lobes er ryddet, og ligate tolvfingertarmen på slutten med to separate suturer.
Den delen av tolvfingertarmen som er i nær kontakt med forbindelsen og duodenalappene fjernes med bukspyttkjertelen, da ligation av alle de små blodkarene mellom de to organene er for vanskelig. Etter dissekering portalvenen, ligate fartøyet med en sutur for å forhindre blodlekkasje fra leveren, og dissekere og ligate gallekanalen og leverarterien med to suturer. Deretter kutte portal vene, leverarterie, og gallegang med saks.
Finn aorta under nyrevenen, og disseker aorta i kranial retning fra muskelen og bindevevet til fartøyet når bukspyttkjertelen. Nå, forsiktig snu bukspyttkjertelen over, og dissekere aorta, holde overlegen mesenterisk arterie og cøliaki stammen intakt. Skjær aortakraniet til cøliakistammen, og sløv dissekere det gjenværende omkringliggende vevet for å tillate høsting av bukspyttkjertelen.
Deretter bruker du en 50-milliliter sprøyte koblet til en fire millimeter arteriotomi kanyle for å skylle orgelet gjennom aorta med løsning to til hele orgelet er perfundert eller til hele orgelet blir kaldt. Plasser løsningen to perfused bukspyttkjertel på et metallbrett på is, med aorta vendt opp, og bruk saks for å kutte suturene fra tolvfingertarmen. Bruk en 25-milliliter pipette til å skylle tolvfingertarmen med 50 til 150 milliliter ultrapure vann, og gjenopplev vevet med friske suturer.
Ligate den ene enden av aorta og alle grenene, unntatt den overlegne mesenteriske arterien og cøliakistammen, for å forhindre lekkasje, og sett inn en fire millimeter arteriotomi kanyle i den andre enden av aorta. Deretter plasserer du bukspyttkjertelen i organkammeret, og kobler kanylen i bukspyttkjertelen til en mannlig Luer. Deretter perfuse bukspyttkjertelen med løsning tre i en time ved 20 milliliter per minutt, og fryse den dobbeltperfused bukspyttkjertelen ved minus 20 grader Celsius i løsning fire til starten av decellularization.
På dagen for å starte decellularisering tiner bukspyttkjertelen ved fire grader Celsius, og plasserer den tinte bukspyttkjertelen i decellulariseringsorgankammeret. Koble vaskemiddelinntaket til aorta i bukspyttkjertelen, og vask bukspyttkjertelen med løsning tre ved 20 milliliter per minutt over natten ved fire grader Celsius. Neste morgen, dekantere noen løsning som gjenstår i orgelkammeret, og perfuse bukspyttkjertelen i 30 minutter ved 20 milliliter per minutt i løsning fem ved fire grader Celsius.
På slutten av løsningen fem perfusjon, perfuse bukspyttkjertelen i åtte timer på 20 milliliter per minutt i løsning seks og fire grader Celsius, etterfulgt av en 96-timers vask i frisk løsning fem på 20 milliliter per minutt og fire grader Celsius. Erstatt vasken med 500 milliliter DPBS supplert med kalsium og magnesium i 30 minutter ved 37 grader Celsius, etterfulgt av perfusjon med 250 milliliter løsning syv i fire timer ved 20 milliliter per minutt og 37 grader Celsius. Vask deretter orgelet i ytterligere 120 timer med frisk oppløsning fem på 20 milliliter per minutt og fire grader Celsius, og lagre orgelet i løsning åtte.
Her kan den grove morfologien til en normal bukspyttkjertel, som vises lys rosa og inneholder milt, tilkobling og duodenalapper, observeres. Etter decellularisering går den rosa fargen tapt, og den bearbeidede bukspyttkjertelen vises blek hvit i fargen. I en normal bukspyttkjertel er mange blå kjerner tydelige ved H- og E-farging, mens kjernene i en decellularisert bukspyttkjertel ikke lenger kan visualiseres, noe som bekrefter tapet.
Den isolerte intakte svinepankreasen, etter denne prosedyren, vil det tillate en fullstendig perfusjon og vellykket decellularisering samtidig som strukturen bevares og også tillater noen ekstracellulære matriseproteiner å oppnås. Decellularisert bukspyttkjertel kan brukes til å utvikle helorgan recellulariseringsstrategier i bioreaktorsystemer med relevante celletyper. Etter recellularisering med mottaker stamceller, vev konstruert bukspyttkjertel kan brukes til kliniske anvendelser og narkotikatesting.
Ikke glem at det å jobbe med Triton X-100 og SDC kan være ekstremt farlig, og at forholdsregler, som bruk av hansker og klargjøring av løsningene under røykhette, alltid bør tas mens du utfører denne prosedyren.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
