Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Zuivering van Low-overvloedig cellen in het visuele systeem van Drosophila
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier presenteren we een cel dissociatie protocol voor het efficiënt isoleren van cellen aanwezig bij lage overvloed binnen het visuele systeem van Drosophila door fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS).
Transcript
Deze methode kan helpen bij het aanpakken van belangrijke vragen in de biologie, zoals hoe diverse celtypen worden gegenereerd en georganiseerd in structuren met een hogere orde met specifieke functies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een efficiënte zuivering van cellen vergemakkelijken die aanwezig zijn bij een lage overvloed in het Drosophila visuele systeem voor transcriptomische en genomische analyse. Op dinsdag van week zes van het protocol, 45 minuten voor de dissecties, haal een flesje papaïnepoeder uit vier graden Celsius en incubeer het bij kamertemperatuur.
Zet vervolgens Complete Schneider's Medium, of CSM, opzij in een Eppendorf buis bij kamertemperatuur om later toe te voegen aan het papaïnepoeder. Vijf tot tien minuten voor de dissecties, gebruik een spuit om de kamertemperatuur CSM toe te voegen aan de flacon van papaïne direct via de dop tot een concentratie van 100 eenheden per milliliter. Om te mengen, eerst omkeren van de flacon om te vangen poeder vast te zitten aan de binnenkant van de dop en vervolgens pipette de inhoud op en neer.
Na het mengen van de reagentia, breng het water tot 37 graden Celsius in een beker in een waterbad. Plaats vervolgens het flesje 30 minuten in het bekerglas om de papaïne te activeren en zorg ervoor dat de flacon niet zweeft. Terwijl de papaïne is uitbroeden, haal een aliquot van proteolytische enzym mengsel uit de vriezer en uitbroeden bij kamertemperatuur.
Na 30 minuten activeren, de papaïne bij kamertemperatuur uitbroeden. On tuesday of week six ontleden de geënsceneerde pupilhersenen in het koude CSM met schone tangen. Ontleed zoveel mogelijk hersenen in 10 minuten en pool de hersenen in een verse druppel koude CSM.
Snijd de optische lobben door knijpen op de kruising van de optische kwab en de centrale hersenen. Voeg vervolgens de lobben toe aan de onderkant van een microtube met 500 microliter van 1x RS. Een microbuis voor het experimentele weefsel en een voor het negatieve controleweefsel. Hou de buizen op ijs.
Ontleed zoveel mogelijk lobben in een uur. Pool de ontleed optische lobben in een enkele microbuis om weefselverlies tijdens de overdracht tussen microbuisjes te elimineren. Verwijder voorzichtig de 1x RS uit de microbuis met de ontleed optische lobben met behulp van een P200 pipet, waardoor er genoeg oplossing is om de lobben te bedekken.
Voeg voorzichtig 500 microliter van 1x RS toe aan de zijkant van de buis. Laat de lobben vestigen aan de onderkant van de buis, dan pipette tot 200 microliters. Verdrijft de mix, observeer de lobben en laat de lobben zich weer nestelen.
Voor de twee monsters, aliquot 600 microliters van geactiveerd, kamertemperatuur papaïne in een microbuis. Maak vervolgens de dissociatieoplossing. Voeg 4,2 microliter van kamertemperatuur proteolytische enzym mix in 600 microliter papaïne oplossing om een uiteindelijke concentratie van 0,18 WU per milliliter te verkrijgen en meng de oplossing door pipetting het op en neer.
Verwijder vervolgens voorzichtig de 1x RS uit elk monster en voeg 300 microliter dissociatieoplossing toe aan de kwabben. Broed de monsters uit op 25 graden Celsius. 1.000 RPM gedurende 15 minuten in een microtube ThermoMixer.
Stop bij de tijdstippen van 5 en 10 minuten de ThermoMixer en laat de lobben naar de onderkant van de microbuis zinken. Pipette up 200 microliters van de oplossing en mix. Wacht na de incubatie van 15 minuten tot de lobben zich naar de bodem nestelen en verwijder de dissociatieoplossing voorzichtig uit de kwabben zonder de lobben te storen.
Was de kwabben twee keer met 1x RS. Voeg voorzichtig 500 microliter van 1x RS toe zonder de lobben te storen. Dan voorzichtig pipette tot 200 microliters en voorzichtig verdrijven van de oplossing. Laat de lobben naar de bodem zinken en herhaal.
Was vervolgens elk monster twee keer met 500 microliters van CSM. Verwijder voorzichtig de CSM en voeg nog eens 200 microliter CSM aan de buis toe. Met behulp van een P200 pipet, verstoren het weefsel door pipet op en neer zonder schuimen totdat de oplossing homogeen is.
Met behulp van een P200 pipet, filter de cel suspensie door middel van een 30 micrometer mesh cap in een 5 milliliter fax buis op ijs. En zorg ervoor dat de hele vering doorgaat. Voeg 500 microliter CSM toe om de dissociatiemicrotube te spoelen.
En filter de oplossing in de faxbuis. Ten slotte, voorzichtig opstijgen van de dop van de fax buis. Verzamel de oplossing onder het meshfilter met een P200 en voeg deze toe aan de rest van de suspensie in de faxbuis.
Confocale microscopie van immuno bevlekte lobben met antilichamen die specifiek zijn tegen DsRed en GFP, evenals het 24B10-antilichaam als referentie voor de Lamina- en Medulla-neuropils, bevestigden dat L3 het enige celtype is dat door zowel DsRed als GFP in de optische kwab is gelabeld. Feiten gegevens van 100.000 gebeurtenissen werden geregistreerd, waarvan 29,9% van alle gebeurtenissen zijn potentiële singlets. Nadat doubletten in cellen met verschillende groottes werden uitgescheept op basis van granulariteit en grootte, verschenen de resterende enkele cellen, L3-neuronen, als strakke clusters in P1, die goed gescheiden was van de achtergrondcellen.
Na deze procedure kunnen andere methoden zoals RNA-seq of ATAC-seq worden uitgevoerd om biologische vragen aan te pakken door de analyse van respectievelijk genexpressie of chromatineorganisatie. Deze techniek bevordert aanzienlijk het vermogen van onderzoekers om de genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en functie van complexe weefsels met behulp van de Drosophila visuele systeem als een model te verkennen.
Tags
Genetica kwestie 139 Drosophila visuele systeem optic lobe neuronen cel dissociatie FACS RNA-sequencing MARCM genetische mozaïek lage overvloedRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
