Genetics
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Onderzoek naar de transcriptionele rol van een RUNX1 Intronic geluiddemper door crispr/Cas9 Ribonucleoprotein in acute myeloïde leukemie cellen
Chapters
Summary September 1st, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Directe levering van voorgemonteerde Cas9/gids RNA RiboNucleoProteïne-complexen is een snel en efficiënt middel voor genoom bewerking in hematopoietische cellen. Hier gebruiken we deze aanpak om een RUNX1 intronic geluiddemper te verwijderen en de transcriptionele responsen in OCI-AML3 leukemische cellen te onderzoeken.
Transcript
Cis-regulerende elementen zoals promotors en versterkers zijn belangrijke determinanten van genexpressie. Traditionele benaderingen om deze elementen te bestuderen zijn omslachtig en vaak het gebruik van heterologe reporter genen. Hier tonen we het gebruik van CRISPR om de transcriptierol van een RUNX1 intronic demper in de leukemiecellijn te onderzoeken.
Het protocol is eenvoudig uit te voeren en maakt snelle beoordelingen van genregulerende functies in de endogene gencontext mogelijk. Hematopoietische cellen zijn vaak moeilijk te transfecteren met een plasmide gebaseerde methoden. In dit protocol gebruiken we de elektroporatie om voorgemonteerde Cas9, gids RNA, complexen in de cellen te leveren.
De voordelen van deze aanpak zijn onder meer het gebruik van verbeterde bewerkingsefficiëntie en celrenysorvriendelijkheid en verminderde off-target effecten. Ook het latere gebruik van fragmentanalyse maakt een eenvoudige en snelle screening van de gewenste mutant klonen van een grote hoeveelheid monsters. Het aantonen van de procedure zal Yuk-Lin Yung zijn, technicus voor mijn laboratorium.
Begin met het ontwerpen van twee CRISPR RNAs, een vijf prime en de andere drie prime van het doel cis-regelgevende element, of CRE. Zorg ervoor dat een PAM van NGG zich direct stroomafwaarts van de doelvolgorde bevindt voor Cas9-herkenning. Om het gRNA-complex te vormen, combineert u het CRISPR RNA en het tracer RNA in TE-buffer volgens de handschriftaanwijzing, voor een uiteindelijke duplexconcentratie van 44 micromolar.
Broed het mengsel vijf minuten lang op 95 graden celsius en laat het afkoelen tot kamertemperatuur. Verdun de recombinant Cas9 nuclease met PBS voor een uiteindelijke nuclease concentratie van 36 micromolar. Meng vervolgens een gelijk volume van de verdunde nuclease met elk van de gRNA duplexen en broed ze gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om het RNP-complex te laten vormen.
Centrifuge 2,5 miljoen cellen in een buis van 1,5 milliliter bij 500 keer g gedurende vijf minuten. Gooi vervolgens de supernatant weg en schort de cellen opnieuw op in 163 microliter rpmi 1640 medium zonder fenolrood. Voeg 16,7 microliter van het RNP-complex en 3,6 microliter van 100 micromolar elektroporatieversterker toe aan de cellen en breng het mengsel over naar een elektroporatie cuvette met een afstand van 0,2 centimeter, waarbij ervoor wordt gezorgd dat er geen bellen worden geïntroduceerd.
Elektroporate de cellen en breng ze naar een T-25 weefsel cultuur fles met 6 milliliter van volledige RPMI 1640 medium. Broed de cellen in op 37 graden Celsius met 5%koolstofdioxide. Een dag na elektroporatie verdun je de cellen tot 5000 cellen per milliliter in het volledige RPMI 1640-medium.
En voeg 100 microliter van de celsuspensie toe aan elke put van een 96-put weefselkweekplaat. Kweek de cellen zeven tot 14 dagen en extraheer vervolgens genomisch DNA met behulp van een hoogdoorvoerzuiveringssysteem. Voeg 100 microliter plaatbinding en lysebuffer toe aan elke put van een 96-welled extractieplaat, gevolgd door 50.000 cellen die opnieuw zijn opgehangen in 10 microliter van PBS.
Meng de put inhoud door pipetting op en neer. Broed de plaat 30 minuten op kamertemperatuur in om het genomische DNA aan de putten te binden. Spoel vervolgens voorzichtig de oplossing uit de putten aan en was ze met 120 microliter wasbuffer.
Lucht droogt de plaat. Voeg 20 microliters van PCR mix aan elke goed en draaien PCR volgens manuscript aanwijzingen. Zodra de versterking is voltooid, schat u de hoeveelheid van het product door de concentratie van een geselecteerd aantal monsters te meten met een fluorometer.
Verdun alle monsters tot 0,5 nanogram per microliter met nucleasevrij water. Meng een microliter van het verdunde PCR-product met 8,5 microliter gedeïoniseerde formamide en 0,5 microliter fluorescerende kleurstof-gelabelde maat standaard in een 96-well plat compatibel met de genetische analyzer. Bedek de plaat met een plaat septa en denatur de monsters op 95 graden Celsius gedurende drie minuten in een thermocycler.
Voer capillaire elektroforese uit om de gelabelde PCR-producten te scheiden en de resultaten van de analysesoftware te analyseren. Controleer het oranje pictogram om de gelabelde fragmenten en de groottestandaard te bekijken om de kwaliteit van de grootte aanroepen te beoordelen. Controleer vervolgens het blauwe pictogram om de gelabelde PCR-producten weer te geven.
Identificeer de pieken die overeenkomen met producten van het wilde type en mutanten en schat het mutantsniveau in elk monster door het gebied onder de mutantenpiek te delen door de som van het gebied onder de wild-type en mutantpieken. Selecteer meerdere celpools met een hoog niveau van de verwachte verwijderingen voor verdere seriële verdunningen. Herhaal de DNA-extractie, fluorescerende PCR- en capillaire elektroforesestappen en selecteer klonen met een gemuteerde gehalte van meer dan 95%voor latere analyse.
Haal het totale RNA uit de geselecteerde klonen en voer gratis DNA-synthese uit. Meng het RNA met een poly-T primer en dPP's volgens manuscriptaanwijzingen en broed vijf minuten lang uit op 65 graden Celsius. Plaats vervolgens de reactie minstens één minuut op ijs.
Voeg tien microliters van cDNA synthese mix aan de reactie. Vervolgens incubeer het monster op 50 graden Celsius gedurende 50 minuten en 85 graden Celsius gedurende vijf minuten in een thermocycler. Behandel de monsters na de cDNA-synthese met één microliter RNase H en broed ze gedurende 20 minuten uit op 37 graden Celsius.
Ontwerp primers en TaqMan sondes specifiek voor individuele transcript variantie gegenereerd door alternatieve promotors en kloon de DNA-fragmenten met de specifieke transcriptiesequenties in plasmid DNA. Maak een tienvoudige verdunningsreeks van de recombinant plasmiden als standaardcurven voor transcriptkwantificering. Bereid 20 microliter pcr-mix voor elk monster en voer de real-time PCR uit volgens de hand van manuscriptaanwijzingen.
Analyseer de resultaten en normaliseer het kopienummer van de doeltranscripties in elk monster met een huishoudgen. Dit protocol is met succes gebruikt om de RUNX1 intronic demper te verwijderen en de verwijdering werd bevestigd met capillaire gel elektroforese. De verwachte maten van de wild-type en mutant PCR producten zijn ongeveer 500 base paren en 230 base paren respectievelijk.
De grootte van de gemuteerde producten kan variëren tussen de klonen als gevolg van indels gevormd op het decolleté sites. Sanger sequencing werd gebruikt om de identiteit van de verwijderingen te bevestigen. Het RUNX1-gen bevat twee promotors, P1 en P2 die drie belangrijke mRNA-transcripties produceerden: RUNX1c by P1, en RUNX1a en RUNX1b by P2. Real-time kwantitatieve PCR kan worden gebruikt om te bepalen hoe de verwijdering van de demper element van invloed is expressie van deze transcripties.
Een goed ontwerp van CRISPR RNAs is belangrijk voor de beoordeling van het experiment. Zorg ervoor dat het CRSIPR RNA dicht bij het beoogde verwijderingsgebied is verpakt. Zorg er ook voor dat er een PAM-sequentie zich stroomafwaarts van de doelvolgorde bevindt voor Cas9-herkenning.
Afgezien van het bestuderen van CRE's, kan deze strategie worden gebruikt voor genlocatiestudies en dient als een alternatief voor RNA-interferentie om genfuncties te onderzoeken. Door te combineren met chromosoomconformatiefvangtechnieken zal CRISPR zeker helpen bij het ontcijferen van de betrokkenheid van CRE's in de veranderde genoomorganisatie en genexpressie in verband met verschillende gezondheidsproblemen zoals kanker.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
