Genetics
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Cel gebaseerde analyses van SINEUP niet-coderende RNAs die specifiek mRNA vertaling kunnen verbeteren
Summary February 1st, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
SINEUPs zijn synthetische antisense niet-coderende RNAs, die bevatten een bindend domein (BD) en een effector domein (ED) en up-reguleren vertaling van mRNA richten. Hier beschrijven we detectiemethoden voor SINEUPs in gekweekte cellijnen, analyse van hun vertaling-bevordering van activiteiten door Western-blot en een semi-automatische hoge doorvoer imaging systeem.
Transcript
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen, zoals hoe de activiteit van een gen positief te matigen, door gebruik te maken van mRNAs die aanwezig zijn in de cellen en weefsels. Hoe te compenseren voor tekortkomingen in de activiteit, en hoe een hoge vertaling van mRNAs in vitro en in vivo te bereiken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we wereldwijd de doelgenen van SINEUP in levende cellen kunnen screenen, door beeldvorming zonder fixatie en verzameling.
Dus de implicaties van deze techniek breiden zich uit tot onze therapie van haploinsufficient instances, omdat SINEUPs kunnen leiden tot een tweevoudige toename van een tekort eiwit, zoals frataxie in gevallen van Friedrich's ataxie. Open om te beginnen de Zenbu-browser en klik op fantom-projectdatabase van belang. Zoek in het doelgen en controleer op de startlocatie van transcriptie of TSS en expressieniveau in gewenste cellen en weefsels.
Raadpleeg de voorbeeldanalyse van het eiwit zeven van de ziekte van Parkinson of PARK7 mRNA om TSS te bepalen. Controleer TSS per kooi piek regio. Als u cel- en weefselspecifieke transcriptieexpressieniveaus wilt bepalen, selecteert u het kooipiekgebied en klikt u op een genomisch gebied vergroten om te selecteren.
Controleer park7 expressie in de cel en weefsel type van belang, door het verkennen van de transcriptie expressie lijst aan de onderkant van de pagina. Ontwerp vervolgens bindende domeinsequenties van verschillende lengtes die overeenkomen met 40 basen stroomopwaarts en 32 basen stroomafwaarts van de eerste methionine of AUG. Vóór transfectie met SINEUPs, zaadcellen van belang op twee poly-d-lysine gecoat 24 put platen, zoals beschreven in het manuscript.
24 uur lang incueën bij 37 graden celsius in een vijf procent CO2-incubator om 70 procent samenvloeiing te bereiken. Het is zeer belangrijk om cellen gelijkmatig in de putten te verdelen, hiervoor schud je de plaat voorzichtig 10 keer heen en weer na het zaaien van de cellen in een schone bank en herhaal in de vijf procent CO2-incubator. Na de incubatie, verander het medium tot 0,4mL van vers medium.
Voor het analyseren van SINEUP-GFP maken verschillende 1,5 mL buizen met 0,1 mL gemengde oplossing, met pEGFP-C2, SINEUP-GFP, transfectie reagentia en OptiMEM in elke buis, en vervolgens incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Voeg 0,1 mL van deze gemengde oplossing van elke buis toe aan een aparte put van een 24 putplaat en label deze putten met SINEUP-GFP een, twee, drie, vier en vijf. Broed de plaat 24 uur lang in een vijf procent CO2-incubator op 37 graden Celsius.
Na 24 uur was je de cellen met 0,5 mL PBS. Voeg 25uL van 0,05 procent gewicht per volume trypsine, en incubeer in een vijf procent CO2 incubator gedurende vijf minuten. Voeg 275uL celmedium per put toe.
Voor eiwitextractie, neem een van de twee platen, en oogst 225uL of driekwart van de cellen uit een put, en 75uL of een kwart van de cellen voor RNA extractie, elk in een aparte 1,5 mL buis. Centrifuge op 6000xg gedurende vijf minuten op vier graden Celsius. Verwijder na centrifugatie het supernatant voorzichtig uit de buis die is gelabeld door eiwitisolatie.
Voeg 60uL lyseoplossing toe aan de cellen en meng door pipet mix grondig door een uur lang met een lage snelheid te draaien bij vier graden Celsius. Centrifuge de buis op 14, 000xg gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius om eiwit supernatant te verzamelen. Om de eiwitconcentratie te bepalen, moet u eerst vijf tot zes keer verdunning van verse boviene serumalbumine-eiwitstandaard in ultrazuiver water bereiden, met concentraties variërend van 0,2 tot 1,5 mg/mL-eiwit.
Ter voorbereiding van werkende reagens Een Dash mix toe te voegen 20uL reagens S tot een mL van reagens A in een twee mL buis. Voeg vijf uL water als een negatieve controle. En dan, BSA standaard of eiwit monster in elke put.
Voeg 25uL reagens A Dash toe en voeg vervolgens voorzichtig 200uL reagens B per put toe, waardoor elke belvorming wordt vermeden. Bedek de plaat met aluminiumfolie om vijf tot acht minuten op kamertemperatuur uit te broeden. Meet de eiwitabsorptie op 750nm met een spectrofotometer.
Bereid een standaardcurve voor door bsa-standaardewitconcentraties op de x-as en hun respectieve absorptie op de y-as in te plotten. Breng een standaardcurvevergelijking toe om de monstereiwitconcentratie te berekenen. Om te beginnen eiwit scheiding, voeg een volume van 2x laden kleurstof aan elk volume van het eiwitmonster.
Verwarm op 90 graden Celsius gedurende vijf minuten, en onmiddellijk afkoelen op ijs voor een minuut. Laad 10 tot 20ug eiwitmonsters tot 10 procent SDS polyacrylamide gel en los bij 100 tot 150V. Breng het eiwit van de gel naar een 0,5 micrometer nitrocellulose membraan, door middel van een semi-droge overdracht instrument.
Vul met transferbuffer op 25V gedurende 30 minuten. Na de overdracht, plaats het membraan in een container, en voeg blokkeren oplossing totdat het membraan is volledig gedrenkt, en uitbroed het op kamertemperatuur gedurende 30 minuten met schudden. Voeg het juiste antilichaam toe aan de blokkerende oplossing en giet over het membraan.
Hybridiseren door het membraan 30 minuten uit te broeden bij kamertemperatuur, tijdens het schudden. Na hybridisatie, was het membraan door het toevoegen van 1x TBST buffer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, en herhaal nog twee keer. Voer de volgende hybridisatie uit met een secundair antilichaam verdund in het blokkeren van oplossing over het membraan, bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tijdens het schudden.
Was vervolgens het membraan door het toevoegen van 1x TBST buffer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, en herhaal nog twee keer. Breng het membraan over op een doos gevuld met twee mL hrp-verbeterde ECL-reagensmix. Bedek de doos met aluminiumfolie en broed gedurende één tot twee minuten bij kamertemperatuur.
Verwijder het membraan voorzichtig uit de ECL-reagensmix en leg het bloot met behulp van een luminescentie-beeldvormingsinstrument. Om het effect van SINEUP-GFP in cellen te analyseren door beeldvorming, was de pEGFP-C2, en SINEUP-GFP doorgesneden cellen van de tweede 24 put plaat met 0,5 mL PBS per goed. Om de kern te bevlekken, voeg 2ug hoechst-33342 aan elke put, en incubbate cellen op 37 graden Celsius, gedurende 20 minuten.
Gebruik een hoge doorvoer microwell beeld cytometer om Hoechst gekleurde cellen te meten, om het totale aantal cellen te tellen. Meet de intensiteit van groene fluorescentie om het aantal GFP-positieve cellen te tellen. Om het eiwit-up regulerende effect van de SINEUPs te analyseren, gebruikt u imagingsoftware om een geïntegreerde GFP-intensiteit te bepalen Bereken deze als de som van alle pixelintensiteiten die signalen weergeven in gesegmenteerde objecten die voor elk kanaal zijn verkregen.
Na een succesvolle transfectie met SINEUP-GFP, een synthetische SINEUP met zowel een optimaal bindend domein als een effectordomein GFP, werd mRNA-vertaling upgereguleerd zonder de expressie van GFP mRNA te veranderen. Een protocol van semi-geautomatiseerde beeldanalyse verbeterde de detectietijd en verhoogde het aantal monsters dat tegelijkertijd wordt gescreend in vergelijking met een conventionele westerse vlekanalyse. Hoewel er een verschil in signaalintensiteit was, van 2,6-voudig in de westerse vlekanalyse tot 1,4-voudig in beeldanalyse, werden aanzienlijk hogere niveaus van GFP-fluorescentie gedetecteerd in vergelijking met de controle.
Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de juiste volgorde van doelmrnas te identificeren om het juiste bindingsdomein te ontwerpen. Genen worden vaak getranscribeerd van promotors, en kunnen verschillende vertaling initiatie site te gebruiken. De Zenbu browser is een zeer nuttig hulpmiddel om dergelijke mRNA variantie te verkennen.
We raden ook aan om verschillende SINEUPs te ontwerpen met variabele bindingssites. Al met al zijn wij van mening dat het snel aanpassen van SINEUPs aan een veelheid aan doelstellingen een nieuw veld zal creëren dat bestaat uit een positief gereguleerde vertaling van bestaande RNA's, die een wederkerige en complementair is aan het veld van siRNA. Een deel van die functie die we voor ogen hebben, is dat deze technologie instrumenteel zal zijn om grotere hoeveelheden eiwitten in vitro te produceren, zoals bioreactoren, en in vivo om de gendosering op natuurlijke wijze te corrigeren.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE