Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kvantificeringen af antistof-afhængige Enhancement Zika virus i primære humane celler
Chapters
Summary January 18th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver en metode til at vurdere effekten af allerede eksisterende immunitet mod dengue virus på Zika virusinfektion ved hjælp af humant serum, primære menneskeceller og infektion kvantificering af kvantitative real-time polymerase kæde reaktion.
Transcript
Denne metode kan anvendes til at vurdere virkningerne af allerede eksisterende immunitet mod denguevirus på Zika virus infektion, ved hjælp af faktiske menneskelige patient serum og primære menneskelige immunceller. Brugen af faktiske humane patient serumprøver og menneskelige primære celler giver dybere indsigt i antistofafhængig forbedring af Zika virus ved præ-immun sera og antistoffer. Denne metode giver indsigt i antistoffers evne i en patients blod til at forbedre en virusinfektion i andre humane celler.
Det er vigtigt at sikre, at virusinfektionsniveauet er højt nok til påvisning, men lavt nok til ikke at overvælde cellerne eller forstyrre datafortolkningen. Begynd med at så tre gange ti til de fjerde celler i 100 mikroliter af cellekulturmedium pr. brønd i en steril, flad bund 96-brøndplade. Når alle cellerne er blevet belagt, skal pladen i en 37 grader Celsius og 5% kuldioxid inkubator og gøre 10 gange serielle fortyndinger af optøede menneskelige serumprøver i serumfrit medium.
Sørg for at holde serumfortyndings- og fortyndingsfaktoren konstant for alle præ immune sera, før du tilsætter fortyndingerne til virusopløsningerne og cellerne. Dernæst tø Zika virus stammer bestand løsning i en 37 grader Celsius vandbad i et til to minutter, før hurtigt at overføre bestanden til is. Der tilsættes en 0,1 multiplikation af infektionsækvivalentvolumen zikavirus til serum aliquots og læg pladen i cellekulturskuvøsen i en time for at tillade, at denguevirusantistoffer danner komplekser med Zika-virionerne.
Ved slutningen af inkubationen vaskes cellerne med 100 mikroliter PBS pr. brønd, og der tilsættes 50 mikroliter immunkompleks til hver brønd. Efter to timers inkubation fjernes mediet og vaskes brøndene to gange med 100 mikroliter PBS pr. brønd for helt at fjerne immunkomplekserne og eventuelle uopsatte virioner. Derefter fodres cellerne med 100 mikroliter pr. brønd af cellekulturmedium suppleret med 10 % føtalt kvægserum.
Vend derefter cellerne tilbage til cellekulturskuvøsen i 48 timer. To dage efter infektionen vaskes cellerne to gange med 100 mikroliter steril PBS pr. brønd, før der tilsættes 250 mikroliter cellelysisbuffer med 10% beta mercaptoethanol til hver brønd. Pipette op og ned mindst fem gange med ridser for at fremskynde lysisprocessen og overføre cellelysater til sterile mærkede 1,5 milliliterrør.
Der tilsættes et tilsvarende volumen på 70% ethanol til hvert rør, og lysatopløsningen pipetters op og ned fire til fem gange. Når lysatsuspensionerne er tydelige, overføres hver opløsning til mærkede silicabaserede søjler i to millilitersamlingsrør til centrifugering. Kassér flow-through holde kolonnerne i samme samling rør og tilsæt 700 mikroliter af Vask Buffer 1 til hver kolonne for en anden centrifugering.
Efter at gennemstrømningen er kasseret, skylles kolonnerne to gange mere med 500 mikroliter vaskepude to pr. vask. Efter den anden vask overføres kolonnerne til nye to milliliteropsamlingsrør til endnu en centrifugering. Tilføj 30 mikroliter på 42 grader Celsius RNase-Frit vand til midten af hver kolonne for centrifugering og genvinde den eluterede RNA.
For kvantitative real-time polymerase kædereaktion eller QRTPCR analyse tilføje en mikroliter af genspecifikke fremad og omvendt primere fra 10 mikromolar bestande sammen med 0,25 mikroliter af omvendt transskription mix per reaktion. Bemærk, at primere, der genkender Zika virus genetisk materiale vil opdage virale gener og give mulighed for infektion kvantificering. Dernæst tilsættes 12,5 mikroliter SYBR Green Mix efterfulgt af 25 mikroliter vand til hver reaktion tilføje 15 mikroliter Af Master Mix i hver brønd af 96-godt QPCR plade.
Når du bruger en Master Mix, tilsættes 100 nanogram af RNA-prøven til blandingen og pipette Master Mix i individuelle brønde af QRTPCR plade. Bemærk, at prøverne skal køres i tre eksemplarer på samme QRTPCR plade. Kør derefter prøverne på en kvantitativ PCR-maskine i henhold til de parametre, der er beskrevet i tabellen.
Ved at klikke på fanen smeltekurve i systemsoftwaren for at overvåge smeltekurven. Smeltekurven vil vise enkelt top i alle prøverne for et bestemt gen for at bekræfte tilstedeværelsen af kun én amplicon. For optimale resultater skal du bruge 0,5 grader Celsius temperaturstigninger mellem trin og en minimumsholdningstid på 10 sekunder i smeltekurveprotokollen.
Klik derefter på fanen kvantificeringsdata for at få en kvantitativ cyklus for hver stikprøve, og eksportér dataene til et regneark for yderligere kvantificeringsanalyse. Human serum prøver kan kategoriseres i tre forskellige grupper: dengue virus infektion bekræftede prøver, dengue virus antistof bekræftede prøver, og sund sera uden dengue virus neutraliserende antistoffer eller RNA. Efter 48 timers infektion, QRTPCR analyse viser, at de fleste sera indeholder dengue virus serotype en til fire antistoffer er i stand til at forbedre Zika virus replikation på forskellige niveauer.
Den største stigning i zikavirustitre findes i makrofager behandlet med seraholdige denguevirus serotype to og fire antistoffer sammenlignet med serotype et og tre, som viser en relativt lavere induktion af Zika-virus. Det er vigtigt at opretholde et sterilt miljø, at bære det korrekte personlige beskyttelsesudstyr og altid at opbevare de optøede virusserumprøver og QPCR-reagenser på is. Denne protokol kan nemt ændres til at studere antistof-afhængige forbedring af andre flavivirus såsom gul feber virus, dengue virus, eller West Nile virus ved hjælp af et panel af patient serum.
Denne teknik vil være meget nyttig til at udføre fremtidige antistof-afhængige ekstraudstyr undersøgelser i arbovirus eller virologi områder. Korrekt biosikkerhedsniveau to personlige beskyttelsesudstyr bør anvendes til enhver tid, og alt viralt affald bør dekontamineres i 10 %blegemiddel i 30 minutter før bortskaffelse.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
