A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.
Transcript
Het doel van dit videoprotocol is het vaststellen van een bron en efficiënt protocol voor embryonale muis neurale stamcelisolatie en -cultuur. Hallo, ik ben Maryam Sadeghi-Zadeh. Ik ben een master student cellulaire en moleculaire biologie in Royan Institute.
Vandaag willen ik en mijn collega je laten zien hoe je neurale stamcel oogsten van 13 embryomuis ganglionic eminentie. Hallo, ik ben Bahareh Alizadeh-Shoorjestan. Ik ben een master student voor cellulaire en moleculaire biologie in de stemcel afdeling van Royan Instituut voor Biotechnologie.
Hallo, ik ben Reza Dehghani-Varnamkhasti. Ook studeer ik cellulaire en moleculaire biologie aan het Royan Instituut. Chirurgische ingrepen omvatten het oogsten van elke 13 muisembryo's uit de baarmoeder.
Het snijden van de voorkant van fontanel van embryo met een gebogen naald tip het extraheren van de hersenen uit de schedel. Micro-dissectie van geïsoleerde hersenen om de ganglionic eminentie te oogsten. Dissociatie van het geoogste weefsel in een neurale stamcel medium om een enkele cel suspensie te krijgen.
En tenslotte, plating cellen in een suspensie cultuur om zenuwcellen te genereren. Reinig en ontsmettingsmiddel de huid van de buik gebied door te spuiten met 70%ethanol. Controle van de huid omhoog buik en snijd vervolgens de huid en onderstreept gezicht met een schaar om buikholte en baarmoeder hoorns te ontdekken.
Verwijder de baarmoederhoorns die de embryo's met een schaar bevatten en breng ze over in een conische buis van 50 ml met een koude HEPES MEM-buffer van 25 ml. Plaats de conische buis onder de laminale stroomkap. Open de dop onder de motorkap.
Haal de baarmoederhoorns uit de buis en spoel drie keer met voldoende volume van de verse koude HEPES MEM-buffer om vuil en bloed te elimineren. Breng het baarmoederweefsel over in een petrischaal van 10 cm met een koude HEPES MEM-buffer van 7 tot 10 ml. Open de baarmoederhoorns met een fijne schaar en breng embryo's over naar een nieuw gerecht met een koude HEPES MEM-buffer van 7 tot 10 ml.
Zet nu de 10 cm schotel met embryo's onder de ontledenmicroscoop voor micro-dissectie operatie. Buig de punt van een spuitnaald door zijn punt op een stalen scalpel mesgreep te duwen. Buig de punt van de naald tot de punt is gebogen onder een hoek van 70 tot 90 graden.
Controleer de punt van de naald onder de ontledenmicroscoop om de bocht aan de punt van de naald te zien. Natuurlijk hebben embryo's hierin een zijdelingse positie. Zonder hun positie te veranderen, hield de hals en het lichaam van het embryo met fijne tangen en vervolgens het gebogen deel van de naald diep in de voorkant van de fontanel van het embryohoofd.
Er zou een kleine bloeding of een bloedstolsel zijn. Beweeg de naald tip oppervlakkig, terwijl het gebogen deel is in de uitstulping in de richting van het voorhoofd en vervolgens naar de achterkant van het hoofd. Zorg ervoor dat u door de huid en de schedel snijdt en de onderliggende hersenen niet beschadigt.
Duw de huid met de naald tip zijwaarts om de hersenen te ontdekken. Steek de naald van zijdelingse kant van de huid aan de onder het frame van de zijkant van de huid naar het gebied onder de hersenen. En verwijder dan de hersenen van deze hoofdhuid door het te duwen om uit de ontleedschedel te komen.
De ganglionic eminentie wordt duidelijk getoond in video met zijn mediale en zijdelen. Hield de hersenen stabiel met behulp van de zorg tangen en vervolgens met behulp van microscissors om de cortex van elk halfrond te snijden om de ganglionic eminentie bloot. Hield de hersenen en plaats ontleed ganglionic eminentie in de 15 ml centrifuge buis met neurale stamcel media.
Herhaal deze procedure totdat alle hersenen zijn micro-ontleed. Snijd ontleed ganglionic eminentie door het plaatsen van de pipet tip tegen de onderkant van de buis en pipette de schorsing op en neer voor 2 5 keer op te breken van het weefsel om een enkele cel schorsing te krijgen. Centrifuge de vering op 110 g gedurende 5 minuten.
Verwijder de supernatant en resuspend de cellen in 1 ml van 0,05%buis in EDTA. Incubeer de celsuspensie in een 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. En voeg dan een gelijkwaardig volume van soja-trypsin remmer om trypsine activiteit te stoppen.
Pipette de celopening op en neer om ervoor te zorgen dat de trypsine volledig is geïnactiveerd. Centrifuge de celsuspensie op 110 g gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant en resuspend de cellen in 1 ml van volledige neurale stamcel medium en tellen het aantal cellen.
Plaat de cellen op neurale stamcel medium in de geschikte grootte weefsel cultuur fles. Breng 5 ml 2T25, 20 ml naar T75 en 40 ml over op T175-kolven. Neurosferen verschijnen na 3 dagen cultuur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde couveuse met 5% CO2.
Om cultuur de neurosferen te zuigen, breng het medium met zwevende neurosferen naar de centrifuge om 5 minuten op 110 g te centrifugeren en gooi je de supernatant weg. Bij 1 ml van 0,05% trypsin EDTA en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Dan inactiveren de trypsine met behulp van sojaben tyrpsin remmer en pipet de neurosferen zachtjes op en neer om ze enkele cellen.
Centrifuge de celsuspensie op 110 g gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg en verhoog de cellen in 1 ml neurale stamcellen medium. Deze cellen zijn klaar voor de volgende stap cultuur of cultuur op laminaat en volledig gecoat oppervlak voor geavanceerde experimenten.
Door het cultiveren van een miljoen primaire neurale stamcellen na zeven dagen het aantal cellen zal toenemen tot drie tot vier miljoen. Na zes tot zeven dagen moeten de bollen tussen de 150 en 200 micrometer in diameter meten en klaar zijn voor subcultuur op laminaat poly ornithine gecoate gerechten bij afwezigheid van bFGF en EFGF voor neuronale differentiatie. Flow cytometrie test resultaten tonen aan dat in de buurt van 95% van de cellen die de neurosferen waren Nestin positief, dat is een bekende marker voor neurale stamcellen.
Tests met behulp van beta tubuline III en ganglio vezelige eiwit antilichamen blijkt dat door het cultiveren van neurale stamcellen op gecoate oppervlak ongeveer 94%aangetoond neuronale fenotype en ongeveer 5%tonen glia fenotype. In deze korte video een lab techniek voor snelle isolatie van neurale stamcel van 13 muis embryo ganglionic eminentie. Ik hoop dat je succes zult hebben in je neurale stamcelcultuur.
Tags
Neurowetenschappen kwestie 141 neurale stamcellen isolatie Neuron ganglionaire eminentie muis EmbryoRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
