Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Galleria mellonella Waxworm infektion modell för disseminerad Candidiasis
Chapters
Summary November 17th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Galleria mellonella fungerar som en ryggradslösa modell för disseminerad candidiasis. Här, vi detalj infektionen protokoll och ge underlag för modellens effektivitet.
Transcript
Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i Candidafältet om stam virulens och bidragen från specifika gener till dessa processer. De största fördelarna med denna teknik är att den undviker oro för djuranvändning, är robust, snabb, billig, och ger ett stort antal djur per experiment. Generellt sett, individer som är nya för denna metod kommer sannolikt att kämpa lite eftersom de kommer att ha vissa svårigheter att bedöma mask lönsamhet före början av experimentet eller de kan ha vissa problem med inkonsekvent injektion av maskar.
Beställ larver från grossister och leverantörer som inte inför hormoner, antibiotika eller andra behandlingar till larverna och som kan leverera och leverera levande exemplar. När larverna anländer, kontrollera varje behållare för att bekräfta larvernas hälsa och livskraft. Friska larver kommer att vara helt nedsänkt under sängkläder, flytta, och som har en gul, ljus solbränna färgning med få larver som innehåller svarta märken eller missfärgningar längs kroppen.
Larverna kan förvaras i sina behållare i ett ventilerat utrymme vid omgivningstemperatur i upp till två veckor. För att förbereda jästceller för Galleria mellonella infektion, odla C.albicans stammar som skall injiceras över natten i tre milliliter av färsk jäst-pepton-dextrose buljong per stam i standardkultur rör på en roterande trumma på medelhög hastighet och 30 grader Celsius. Nästa morgon, samla cellerna genom centrifugering, och tvätta jästen tre gånger i fem milliliter färsk PBS per centrifugering.
Efter den sista tvätten, resuspend celler i en milliliter av färsk PBS och överföra jästen i en mikrocentrifug röret. Seriebespäna cellerna i ytterligare PBS vid en-till-100, en-till-1, 000 och en-till-100, 000 koncentrationer, och räkna cellerna från en-till-100 och en-till-1, 000 utspädningar. Justera cellerna till en 2,5 gånger 10 till de sjunde cellerna per milliliter PBS-koncentration i ett nytt mikrocentrifugrör, och bekräfta noggrannheten hos den infektiösa dosen genom att plätera lämplig volym av den en-till-100, 000 utspädning för att uppnå 100 kolonibildande enheter på en jäst-pepton-dextrosegar plattan för varje kultur som ska användas vid infektion.
För att infektera larverna med Candida-cellerna, först sprida en liten mängd vaxmask sängkläder i en tom, 100-by-15 centimeter steril Petriskål per biologisk replikat, och sterilisera en 10-microliter spruta utrustad med en 26-gauge nål tre gånger med 10 mikroliter på 70%etanol och tre gånger med 10 mikroliter pbs per tvätt. Därefter virvel inokulationen utspädning av C.albicans, och belastning 10 mikroliter av celler i sprutan. Öppna en behållare med G.mellonella larver, och använd ett finger för att försiktigt vända sängkläderna över för att avslöja larver, välja gula, bruna larver av liknande storlek som är vid god hälsa med brist på svart pigmentering på kropparna, med hjälp av mitten och pekfingrarna och tummen för att plocka upp en larv på ett sätt som liknar att förstå en penna.
Rulla larven på ryggen så att benen är vända uppåt, håller hela kroppens längd mellan fingrarna och tummen så att larven inte kan krypa eller dra bort från injektionen. Med den andra handen, rotera sprutan så nålen avfasning är vänd uppåt, och sakta för in hela längden av avfasningen i kroppen i korsningen med det bakersta vänstra benet, se till att nålen tränger in i kroppen och inte bara trycka kroppen av larven inåt. Det mest kritiska steget i detta förfarande är injektion av vaxmasken på ett sådant sätt att skador på larvkroppen minimeras och fullbolusen inokuleras.
Injicera sedan hela 10 mikroliter av Candida inokulat, och extrahera nålen. Samhus upp till 10 larver injiceras från samma Candida kultur i varje 100-by-15-millimeter Petri skålen efter inokulering, och inkubera larven vid 37 grader Celsius i åtta dagar. Kontrollera disken var 24:e timme för att övervaka döden.
Dödligheten kan inledningsvis bedömas genom mörka pigmentering, bildandet av svarta fläckar eller kroppar, och en brist på rörelse. För att bekräfta dödligheten, använd pincett för att försiktigt rulla döende larver på ryggen och peta lätt larvens undersida med pincetterna. Larver som börjar poppa i malar kan ingå i analysen men bör tas bort om de börjar smälta.
Ingen signifikant skillnad i kinetiken för G.mellonella död finns mellan larver smittade noll eller 10 dagar efter ankomst. De karakteristiska sjukdomstecken uppstår hos larver från båda åldrar som ger efter för infektionen, som börjar med missfärgning som ger vika för svarta fläckar före en total förlust av motilitet och så småningom död. Infektion med C.albicans snabbar upp denna process av missfärgning och sjuklighet men ändrar inte avsevärt kaskaden av fenotypiska markörer som leder till döden jämfört med oinfekterade eller PBS-injicerade larver.
Särskilt, infektionen av G.mellonella med parning typliknande homo-eller heterozygotes från någon av de testade kliniskt isolerade C.albicans stammar producerar hög dödlighet jämfört med PBS-injicerade djur, medan injektioner av prototrofa derivat stammar dämpar den dödliga effekten i denna modell. Det är viktigt att komma ihåg att välja friska larver och att vara försiktig i hanteringen av larverna. Om flera stammar kommer att inokuleras, se till att inte låta Candida cellerna sitta i PBS för länge.
Efter detta förfarande kan andra metoder som immunologisk profilering och Candida lokalisering inom larver utföras för att svara på ytterligare frågor om interaktionerna mellan värd och svamp patogen under en infektion. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare att utforska Candida patogenes med hjälp av hög genomströmning format. Glöm inte att arbeta med Candida albicans kräver omsorg och att standard försiktighetsåtgärder, inklusive slitage av personlig skyddsutrustning, alltid bör vidtas när du utför detta förfarande.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
