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Immunology and Infection

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JoVE Journal Immunology and Infection

갤러리아 mellonella Waxworm 감염 모델 전파 칸디 다에 대 한

Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice

Journal (Immunology and Infection)

Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice

Isolation and Th17 Differentiation of Naïve CD4 T Lymphocytes

Journal (Immunology and Infection)

Isolation and Th17 Differentiation of Naïve CD4 T Lymphocytes

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갤러리아 mellonella Waxworm 감염 모델 전파 칸디 다에 대 한

Article DOI: 10.3791/58914-v

November 17th, 2018 •

Matthew J. Dunn¹, Andrew L. Woodruff¹, Matthew Z. Anderson^1,2

¹Department of Microbiology, The Ohio State University, ²Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University

Chapters

Summary
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November 17th, 2018

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갤러리아 mellonella 전파 칸디 다에 대 한 무척 추 동물 모델 역할을 합니다. 여기, 우리는 감염 세부 프로토콜 및 모델의 효과 대 한 지원 데이터를 제공.

Transcript

이 방법은 긴장 독성및 이 프로세스에 특정 유전자의 기여에 관하여 칸디다 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동물 사용에 관한 우려를 피하고, 견고하고 빠르며, 저렴하며, 실험당 많은 수의 동물을 제공한다는 것입니다. 일반적으로 말하기, 이 방법에 새로운 개인 가능성이 실험의 시작 전에 웜 생존가능성을 평가 하는 몇 가지 어려움을 거 야 또는 그들은 웜의 일관성 없는 주입에 몇 가지 문제가 있을 수 있기 때문에 조금 투쟁.

유충에 호르몬, 항생제 또는 그밖 처리를 소개하지 않는 도매업자 및 공급 업체에게서 유충을 주문하고 살아있는 견본을 발송하고 전달할 수 있습니다. 애벌레가 도착하면 각 용기에 확인하여 애벌레의 건강과 생존 가능성을 확인하십시오. 건강한 유충은 침구 아래에 완전히 침수되고, 움직이고, 검은 자국이나 몸을 따라 변색이 있는 유충이 거의 없는 노란색, 밝은 황갈색 색채를 가지고 있습니다.

유충은 최대 2주 동안 주변 온도의 통풍 공간에 용기에 보관할 수 있습니다. 갤러리아 멜론라 감염용 효모 세포를 준비하기 위해, C.albicans 균주를 중간 속도로 회전하는 드럼에서 표준 배양 튜브의 변형당 신선한 효모 펩톤-덱스트로스 국물의 3밀리리터로 하룻밤 사이에 주입되는 균주를 성장시킵니다. 다음 날 아침, 원심분리로 세포를 수집하고, 신선한 PBS 의 5 밀리리터에서 효모를 세 번 씻어 원심분리.

마지막 세척 후, 신선한 PBS의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 마이크로 원심 분리기 튜브로 효모를 전송합니다. 1 대 100, 1 대 1, 000 및 1 대 100, 000 농도로 추가 PBS로 세포를 일렬로 희석시키고 1 대 100 및 1 대 000 희석에서 세포를 계산합니다. 새로운 마이크로센트심분리기 튜브에서 PBS 농도의 밀리리터당 7번째 세포당 2.5배 10으로 세포를 조정하고, 1대 100, 000 희석의 적절한 부피를 도금하여 감염용량의 정확도를 확인하여 1개의 효모-펩톤-덱스트로스 에 100개의 콜로니 형성 유닛을 달성하여 각 배양에 사용되는 배양에 대한 매연성-덱스트로오스 격판에 100개의 콜로니 형성 유닛을 달성한다.

칸디다 세포와 유충을 감염시키기 위해, 먼저 소량의 왁스웜 침구를 생물학적 복제당 100x15센티미터 멸균 페트리 접시에 넣고, 26게이지 바늘이 장착된 10마이크로리터 주사기를 70%의 마이크로리터와 3회 PBS의 3회 살균하였다. 다음으로, C.albicans의 접종 희석을 소용돌이시키고, 주사기에 세포의 10 마이크로리터를 적재합니다. G.mellonella 애벌레의 하나의 용기를 열고, 조심스럽게 유충을 밝히기 위해 침구를 켜기 위해 손가락을 사용하여, 몸에 검은 색소 침착의 부족으로 건강에 좋은 유사한 크기의 노란색, 황갈색 애벌레를 선택, 중간 및 인덱스 손가락과 엄지 손가락을 사용하여 연필을 잡는 것과 유사한 방식으로 하나의 애벌레를 데리러.

애벌레를 등에 굴려 다리가 위를 향하고, 손가락과 엄지 손가락 사이의 몸의 전체 길이를 잡고 유충이 말리거나 주사에서 벗어날 수 없도록합니다. 한편, 주사기를 회전시켜 바늘 벨이 위로 향하도록 하고, 배꼽의 전체 길이를 뒤쪽 왼쪽 다리와 접합하여 몸체에 천천히 삽입하여 바늘이 몸에 침투하고 애벌레의 몸을 안쪽으로 밀어 넣지 않도록 합니다. 이 절차에서 가장 중요한 단계는 애벌레 몸에 손상을 최소화하고 전체 볼루스가 접종되는 방식으로 왁스 웜을 주입하는 것입니다.

그런 다음 칸디다 무접종의 전체 10 마이크로 리터를 주입하고 바늘을 추출합니다. 접종 후 100mm 에서 15밀리미터 페트리 접시에 동일한 칸디다 문화에서 최대 10개의 애벌레를 주입하고 8일 동안 37°C의 유충을 배양합니다. 24시간마다 요리를 확인하여 죽음을 모니터링합니다.

사망률은 처음에 어두운 색소 침착, 검은 패치 또는 바디의 형성 및 운동의 부족에 의해 평가될 수 있습니다. 필멸의 삶을 확인하려면 핀셋을 사용하여 모리번드 유충을 등에 부드럽게 굴리고 애벌레의 밑면을 핀셋으로 가볍게 찌릅니다. 나방으로 새끼를 넣기 시작하는 애벌레는 분석에 포함될 수 있지만 몰트하기 시작하면 제거해야합니다.

G.mellonella 죽음의 운동학에 있는 유충에 있는 유충 감염된 0 또는 10 일 도착 후에 존재하지 않습니다. 질병의 특징적인 표시는 감염에 굴복하는 두 나이에서 애벌레에서 생깁니다, 운동성의 총 손실 및 결국 죽음의 앞에 검은 패치에 방법을 주는 변색으로 시작. C.albicans감염은 변색 및 이환율의 이 과정을 가속화하지만 감염되지 않거나 PBS 주입 된 애벌레에 비해 죽음으로 이어지는 표현표의 폭포를 크게 변경하지 는 않습니다.

특히, 임상적으로 고립된 C.albicans 균주중 하나에서 짝짓기 유형과 같은 호모 또는 이종고를 가진 G.mellonella의 감염은 PBS 주입 동물에 비해 사망률의 높은 비율을 생성, 프로토 트로피크 유도균 균주의 주사는이 모델에서 치명적인 효과를 감쇠하는 동안. 건강한 애벌레를 선택하고 애벌레를 다루는 데 온화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 여러 균주가 접종될 경우 칸디다 세포가 너무 오랫동안 PBS에 앉지 않도록 주의하십시오.

이 절차에 따라, 유충 내의 면역 학적 프로파일링 및 칸디다 국소화와 같은 다른 방법은 감염 시 숙주와 곰팡이 병원체 사이의 상호 작용에 대한 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 연구원이 높은 처리량 형식을 사용하여 칸디다 병증을 탐구하는 길을 열었습니다. 칸디다 알비칸스와 함께 일하는 것은 주의가 필요하며, 개인 보호 장비의 마모를 포함한 표준 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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