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Misurare la forma e la dimensione delle particelle di fango attivo immobilizzato in Agar con una Pipeline di Software Open Source
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Summary January 30th, 2019
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Le dimensioni e la forma delle particelle a fanghi attivi sono parametri importanti che sono misurati utilizzando metodi diversi. Imprecisioni derivano da campionamento non rappresentativo, immagini non ottimali e parametri di analisi soggettiva. Per ridurre questi errori e facilitare la misurazione, presentiamo un protocollo specificando ogni passo, tra cui una pipeline software opensource.
Transcript
Le dimensioni e la forma delle particelle di fanghi attivati sono fondamentali per l'efficienza del trattamento delle acque reflue. Tuttavia, la loro misurazione è spesso ad hoc. Questo protocollo fornisce una misura ripetibile, ben definita e semi-automatizzabile per la loro misurazione.
Il vantaggio principale di questo protocollo è che può misurare una grande popolazione di particelle su una vasta gamma di morfologie riducendo al contempo i pregiudizi soggettivi e sistematici. Mentre questa tecnica è focalizzata sui fanghi attivati, tecnicamente tutto ciò che ha la stessa morfologia delle particelle come le microplastiche può essere misurato con questo metodo. Quando si tenta questa tecnica per la prima volta, provare a fare una piastra alla volta e praticare i movimenti fisici di fare quella piastra.
Inoltre, prenditi il tuo tempo con la microscopia. La versione video di questo articolo è importante perché il campionamento e la preparazione delle lastre richiedono molte piccole tecniche che vengono meglio comunicate visivamente. Inoltre, mostrare e vedere buone immagini di lastre è importante per garantire la riproducibilità.
A dimostrare questo protocollo oggi è Joseph Weaver, un dottorando nel mio laboratorio. Per cominciare, acquisire un campione rappresentativo da una porzione ben miscelata del reattore. Mescolare delicatamente il campione e quindi versare immediatamente il volume determinato del campione in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.
Aggiungere quindi cinque microlitri dell'uno per cento di blu di metilene a ciascun campione. Cap e mescolare il campione invertendo delicatamente il tubo almeno tre volte. Lasciare che i campioni macchiano per almeno cinque ma non più di 30 minuti a temperatura ambiente.
Una volta macchiato, trasferire un volume sufficiente di agar fuso al 7,5% e acqua deionizzata nel tubo di centrifuga per portare il volume totale del tubo tra 6,5 e 9 millilitri. Quindi riacquisire i tubi della centrifuga e invertirli delicatamente almeno tre volte per mescolare il campione nell'agar. Mentre si punta il cappuccio lontano da se stessi, aprire il cappuccio.
Versare il contenuto del tubo di ogni tubo nella propria piastra di petri di plastica da 100 millilitri mentre si dondola delicatamente la piastra per ottenere un rivestimento pieno e liscio e una distribuzione visivamente uniforme delle particelle. Lasciare raffreddare le piastre a temperatura ambiente per almeno 5 minuti, fino a quando l'agar non si solidifica. Posizionare la piastra scoperta a faccia in su sullo stadio del microscopio di un microscopio stereo in grado di ingrandimento da 10 a 20 volte.
Illuminare il campione dal basso con una luce anche diffusa, utilizzando apparecchiature come un supporto illuminante a LED o una piastra luminosa. Aprire il software di acquisizione delle immagini e assicurarsi che il percorso della luce del microscopio sia impostato sulla foto. Quindi, selezionare la fotocamera appropriata dall'elenco della fotocamera.
Regolare il microscopio in modo che più particelle appaiano nel piano focale con bordi grandi e ben definiti. Utilizzare un ingrandimento da 10 a 20 volte per misurare le particelle mantenendo un piano focale relativamente profondo. Rimuovere temporaneamente la piastra di agar e posizionare il micrometro sul palco.
Regolare la messa a fuoco fine fino a quando le graduazione sul micrometro appaiono fortemente focalizzate nel software di acquisizione delle immagini. E calibrare il rapporto pixel/micron. Impostare quindi lo zoom sul 100% facendo clic sulla visualizzazione e selezionando le dimensioni effettive.
Quindi selezionare le opzioni e andare a calibrare. Qui, allineare la barra di calibrazione rossa nel riquadro di visualizzazione principale lungo l'asse lungo del micrometro. Con le barre verticali centrate sulle graduazione zero e 200 micron.
Nella finestra di dialogo calibrare immettere il livello di ingrandimento corrente e la lunghezza effettiva di 200 micron. Se è già calibrato, selezionare l'ingrandimento dalla barra dei menu e quindi selezionare il livello di ingrandimento corrente per confermare la calibrazione. Nel menu misure passare alla riga e selezionare linea arbitraria.
Fare clic sull'intersezione tra la graduazione zero e l'asse lungo del micrometro. Quindi fare di nuovo clic sull'intersezione alla linea da 200 micron e sull'asse lungo. Una calibrazione corretta dovrebbe essere visualizzata come circa 200 micron.
Eliminare la riga facendo clic sul pulsante seleziona oggetto, facendo clic sulla riga, premendo CANC e premendo sì nella casella di conferma. Quindi, sostituire la piastra di agar e regolare la messa a fuoco fine per ottenere il massimo dettaglio nel software di imaging. A tale scopo, aumentare innanzitutto la profondità di bit del valore massimo consentito selezionando il pulsante di opzione nel pannello di profondità del bit della barra laterale della fotocamera.
Inoltre, impostare il software per acquisire immagini in scala di grigi selezionando il pulsante di opzione appropriato nel pannello di grado colore della barra laterale della fotocamera. Ora, collassare tutti i pannelli della barra laterale aperti tra esposizione e istogramma. Ridurre il guadagno a uno e aumentare l'esposizione fino a quando non viene visualizzata un'immagine chiara nel riquadro di visualizzazione e fino a quando l'istogramma non viene visualizzato come una distribuzione che non viene ritagliata da nessuna delle due estremità della casella dell'istogramma.
Regolare l'istogramma per evitare un'esposizione eccessiva e inferiore. Nel pannello istogramma della barra laterale della fotocamera, far scorrere il limite sinistro dell'istogramma appena fuori dai valori più bassi e il limite destro appena fuori dai valori più alti. Salvare l'immagine come file TIF non compresso.
Includere le informazioni sull'ingrandimento nei metadati dell'immagine selezionando la casella salva con le informazioni di calibrazione durante il salvataggio. Selezionate un'altra area che non si sovrapponga alle immagini precedenti seguendo un tracciato che alterna da sinistra a destra e da destra a sinistra mentre ci si sposta verso il basso nella piastra. Cattura almeno 500 particelle stimate visivamente per l'analisi.
Acquisire il codice di analisi delle particelle clonando il repository GIT. Nella riga di comando recuperare l'ultima versione del codice digitando il comando mostrato qui. Installare il codice di analisi seguendo le istruzioni nel file di testo Read me trovato nella directory di primo livello del repository clonato.
Modificare quindi un file di testo che elenca le directory da elaborare insieme ai parametri facoltativi. Fare riferimento agli esempi e alla sottodirectory di analisi per un elenco di parametri ed esempi. Ora, esegui l'analisi sulla riga di comando digitando il comando mostrato qui.
Il percorso fiji è la directory in cui imageJ-win64. exe si trova. E paramsfile il percorso del file di testo che descrive l'impostazione dell'analisi.
Il nome dell'eseguibile può variare a seconda del sistema operativo in cui è installato Fiji. L'analisi verrà eseguita automaticamente e richiederà da pochi minuti a poche ore a seconda delle dimensioni e del numero di immagini. Esaminare quindi i file di controllo qualità che si trovano nella sottodirectory di sovrapposizione della directory di output specificata.
Nota immagini con nebbia spuria o particelle scarsamente catturate, tutte apparenti come contorni ombreggiati che non corrispondevano allo sfondo. Questo è tutto. I dati sono ora pronti per l'analisi specifica dell'esperimento e la generazione di figure.
Sebbene nessun metodo di soglia delle particelle sia perfetto, ecco un esempio di risultati accettabili. Quando si valutano le immagini QC, vengono rilevati tre errori comuni. Incapacità di conformarsi accuratamente ai confini delle particelle, mancata identificazione delle particelle e inclusione degli artefatti.
Qui, le distribuzioni di particelle tra due reattori sperimentali nel tempo sono visualizzate e combinate con metadati qualitativi notati dal ricercatore. Questo grafico mostra che in questo caso, i reattori avevano distribuzioni delle dimensioni delle particelle generalmente simili che tendevano verso una media più ampia e una diffusione più ampia con il passare del tempo. Quando si esegue questa procedura, è fondamentale rivestire uniformemente la piastra con un sottile strato di agar contenente particelle distribuite uniformemente.
Assicurati di esercitarti e prenderti il tuo tempo. Al di là di questa procedura, particelle interessanti potrebbero essere asportate dall'agar e studiate. In termini di dati, i file risultanti da questo protocollo sono ben definiti e il cielo è il limite analiticamente.
Questa tecnica ha spianato la strada alla fornitura di nuove informazioni sui fanghi granulari aerobici. La sua morfologia è molto importante e ci ha permesso di misurarla in modo standard. Le acque reflue sono biologicamente attive.
Vengono incoraggiate le pratiche di livello uno per la biosicurezza. Inoltre, come l'agar può bollere quando è microonde e può spruzzare goccioline calde quando si apre il tubo di centrifuga.
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