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पर्यावरण के नमूनों से उच्च प्रवाह Siderophore स्क्रीनिंग: संयंत्र के ऊतकों, थोक मिट्टी, और Rhizosphere मिट्टी
Summary February 9th, 2019
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हम siderophore संभावित सूक्ष्मपोषक जैव उपलब्धता और स्थलीय प्रणालियों में कारोबार के लिए योगदान के लिए पर्यावरणीय नमूनों की तेजी से जांच के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Transcript
साइडरोफोरस कम आणविक वजन, पर्यावरण में लोहे की साइकिलिंग में शामिल धातु-चेलटिंग बायोमॉलिक्यूल्स हैं। यह प्रोटोकॉल मिट्टी और पौधों के नमूनों में साइडोखोर गतिविधि के तेजी से उच्च थ्रूपुट मूल्यांकन की अनुमति देता है। साइडरोफोर डिटेक्शन के लिए पिछले तरीकों ने माइक्रोबियल समुदाय के महत्वपूर्ण वातावरण को समाप्त कर दिया है।
हमारी तकनीक अपेक्षाकृत बरकरार माइक्रोबियल समुदाय और आवास जिसमें यह शामिल के भीतर पता लगाने की अनुमति देता है । क्योंकि लौह उपलब्धता कृषि उत्पादकता के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए इस प्रोटोकॉल में पौधों को लोहे की उपलब्धता को मॉडुलन करने में रोगाणुओं की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, इस विधि का उपयोग मृदा स्वास्थ्य और साइडोफोर उत्पादक समुदायों के साथ-साथ समय के साथ ऐसे समुदायों के विकास पर कृषि प्रबंधन प्रथाओं के प्रभाव का आकलन करने के लिए किया जा सकता है ।
शुरू करने के लिए, एसिड कैस परख में उपयोग करने से पहले कम से कम दो घंटे के लिए 100 मिलीमोलर हाइड्रोक्लोरिक 100 मिलीमोलर नाइट्रिक एसिड में सभी ग्लासवेयर धोएं। प्रयोगशाला ग्रेड रेत से भरा एक एल्यूमीनियम बेकिंग पैन तैयार करें और इसे एल्यूमीनियम पन्नी से कवर करें। ऑटोक्लेव 30 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर और अलग सेट ।
डबल डिएकोनाइज्ड पानी के 20 मिलीलीटर में 0365 ग्राम जोड़कर एचडीटीएमए तैयार करें, और घुलनशीलता को बढ़ावा देने के लिए समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखें। एक बाँझ चुंबकीय हलचल बार के साथ धीरे सरगर्मी करते हुए डबल deionized पानी के 25 मिलीलीटर के लिए कैस के ०३०२ ग्राम जोड़ें । फिर धीरे से हलचल जारी रखते हुए कैस समाधान के 25 मिलीलीटर के लिए एक मोलर आयरन क्लोराइड हेक्साहाइड्रेट के पांच मिलीलीटर जोड़ें ।
अब, धीरे-धीरे धीरे-धीरे एचडीटीएमए समाधान के 20 मिलीलीटर को धीरे-धीरे हिलाते हुए लोहे के कैस जटिल समाधान में जोड़ें। धीरे-धीरे सरगर्मी के साथ डबल डिएकीकृत पानी के 375 मिलीलीटर में 15.12 ग्राम पाइप को भंग करके बफर समाधान तैयार करें। पांच मोलर सोडियम हाइड्रोक्साइड के साथ पीएच को 6.8 में समायोजित करें।
फिर 450 मिलीलीटर तक मात्रा लाने के लिए पानी जोड़ें। अब समाधान के लिए पांच ग्राम एगरेड डालें। ऑटोक्लेव पाइप बफर सॉल्यूशन और आयरन कैस कॉम्प्लेक्स सॉल्यूशन को 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर।
ध्यान से जैव सुरक्षा कैबिनेट में पाइप बफर की संपूर्णता के लिए लोहे के कैस जटिल समाधान की संपूर्णता जोड़ने के बाद उनमें से प्रत्येक को स्वचालित किया गया है । मिश्रित घोल को 50 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखें। अब बायोसेफ्टी कैबिनेट और गर्मी के भीतर बाँझ रेत में एक बाँझ अभिकर्ण नाव ५० डिग्री सेल्सियस के लिए जगह है ।
लोहे के कैस कॉम्प्लेक्स एगर को नाव में स्थानांतरित करें, फिर जल्दी से 100 माइक्रोलीटर को एक स्पष्ट फ्लैट-तली बाँझ 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं में ले जाएं। पहले से तैयार संशोधित M9 माध्यम में 800 माइक्रोमोलर पाइवरडीन मानक तैयार करें। समाधान को 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 और 6.25 माइक्रोमोलर समाधानों में पतला करें।
3.2 मिलीमोलर ईडीटीए मानक तैयार करने के लिए पहले से तैयार संशोधित एम 9 माध्यम के 500 मिलीलीटर में ईडीटीए जोड़ें। इस समाधान को 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, और 6.25 माइक्रोमोलर समाधानों में पतला करें। एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए, आयरन कैस कॉम्प्लेक्स आगर माध्यम के 100 माइक्रोलीटर युक्त 96-वेल माइक्रोप्लेट के कुओं को अलग करने के लिए पाइवरडीन और ईडीटीए की प्रत्येक एकाग्रता के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।
प्रत्येक एकाग्रता की डुप्लीकेट तकनीकी प्रतिकृति बनाएं। इसके अलावा केवल M9 के साथ खाली कुओं जोड़ें। एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करना, 22 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन एक, छह और 24 घंटे के बाद अवशोषण को मापें, और मानक घटता उत्पन्न करने के लिए अवशोषण माप का उपयोग करें। नमूना उपकरण को 22 माइक्रोन फिल्टर डबल डिएकोन्ड पानी के साथ धोएं और उसके बाद 70% इथेनॉल और पेपर तौलिए से पोंछें।
बाँझ तकनीक को बनाए रखने और क्रॉस-संदूषण को कम करने के लिए नमूनों के बीच में नमूने से पहले और धोने का प्रदर्शन करें। पौधे के ऊतकों को उत्तेजित करने और खेत में पौधों से एक छोटी सी रूट बॉल की खुदाई करने के बाद, प्रयोगशाला वातावरण में नमूना अलगाव के लिए रूट बॉल को एक अलग लेबल वाले प्लास्टिक बैग में रखें। सभी नमूनों को सीधे बर्फ पर रखें और चार डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि नमूनों को साइडरोखोर उत्पादन परख के लिए संसाधित नहीं किया जाता है।
अलग जड़ से जुड़े मिट्टी के नमूने थोक में, शिथिल बंधे राइजोस्फीयर मिट्टी और कसकर बंधे राइजोस्फीयर मिट्टी। ऐसा करने के लिए, रूट गेंदों को बैग से बाहर ले जाएं और धीरे-धीरे रूट बॉल से मिट्टी को हिलाएं। मिट्टी से हिल, बैग में छोड़ दिया मिट्टी के साथ, थोक मिट्टी शामिल हैं ।
यह शिथिल बाध्य राइजोसस्फीयर मिट्टी है। कसकर बंधे नमूने के साथ जड़ों को लेने और उन्हें एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में डालने के द्वारा कसकर बाध्य राइजोप्से मिट्टी उत्पन्न करें। दो से तीन मिनट के लिए डबल डिओनाइज्ड वॉटर और भंवर के 30 मिलीलीटर जोड़ें।
कसकर बंधे राइजोस्पाज मिट्टी घोल कमजोर पड़ने पाने के लिए जड़ों को हटा दें। बैग को खोले बिना मिट्टी को जितना संभव हो सके मिश्रण और मोड़कर नमूना बैग के भीतर प्रत्येक मिट्टी के नमूने को समरूप करें। प्रत्येक नमूने को अच्छी तरह से मिश्रित करने के बाद, एक बाँझ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के भीतर संशोधित M9 माध्यम के 20 मिलीलीटर में प्रत्येक मिट्टी के नमूने के दो ग्राम को अलीकोट और निलंबित कर दिया गया है।
नमूना पतला और फिर वातारण की अनुमति देने के लिए एक बाँझ फोम प्लग के साथ ट्यूब सील। कसकर बंधे राइजोस्पायर नमूनों के लिए, एक बाँझ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के भीतर संशोधित M9 माध्यम के 20 मिलीलीटर के लिए राइजोसस्फेयर मिट्टी घोल के दो मिलीलीटर जोड़ें। नमूना पतला और फिर वातारण की अनुमति देने के लिए एक बाँझ फोम प्लग के साथ ट्यूब सील।
ऊतक नमूना तैयार करने के लिए, सतह 70% इथेनॉल के साथ जड़, शूट और अनाज को स्टरलाइज करती है। 30 सेकंड के लिए उच्च पर एक ब्लेंडर का उपयोग कर संशोधित M9 माध्यम के 20 मिलीलीटर में ताजा ऊतक के दो ग्राम Macerate । फिर, नमूने को बाँझ 50 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब, पतला करने के लिए स्थानांतरित करें, और एक बाँझ फोम प्लग के साथ ट्यूब को सील करें।
लोहे की सीमा के माध्यम से साइडरोफोर उत्पादन को समृद्ध करने के लिए कमरे के तापमान पर 50 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूबों को इनक्यूबेट करें और 160 आरपीएम पर हिलाएं। संवर्धन संस्कृति शुरू करने के 24, 48 और 72 घंटे में, बाँझ तकनीक का उपयोग करके संवर्धन ट्यूबों से एक मिलीलीटर सबसमलों को हटा दें। कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए दो मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूबों में एक मिनट के लिए 10, 000 बार जी पर उपाग्नि को अपकेंद्रित्र करें।
बाँझ तकनीक का उपयोग करके, माइक्रोप्लेट के भीतर डुप्लीकेट या ट्रिपलीकेट में लोहे के कैस कॉम्प्लेक्स एगर के 100 माइक्रोलीटर समाधान में सुपरनेटेंट के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। इसके अलावा ब्लैंक के रूप में बाँझ M9 माध्यम के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। इसके बाद थाली को 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
प्रत्येक प्लेट को इनक्यूबेटर में प्लेसमेंट से पहले सील और पन्नी से ढका जाना चाहिए। अपने बाँझ दो मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में प्रत्येक नमूने के लिए शेष सुपरनाटेंट और गोली निलंबित करें। प्रत्येक नमूना सुपरनेट ट्यूब में बाँझ ग्लिसेरोल के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें और ग्लिसेरोल स्टॉक बनाने के लिए गोली को फिर से निलंबित करें।
बाद के विश्लेषण के लिए स्टॉक को माइनस ८० डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें । 420 नैनोमीटर की तरंग दैर्ध्य में छह, 24, 48 और 72 घंटे में अवशोषण को मापें। स्यूडोमोनास फ्लोरोसेन द्वारा आकार के एक पायोवर्डाइन मिश्रण बायोसिंथेस का उपयोग माइक्रोमोलर में पायवरडीन तुल्यता के नमूनों में नमूनों के अवशोषण की व्याख्या और मात्रा के लिए एक मानक के रूप में किया गया था।
420 नैनोमीटर पर अवशोषण और पाइवरडीन की शुरुआती एकाग्रता के बीच संबंध यहां दिखाया गया है। 72 घंटे के संवर्धन की साइडरोखोर गतिविधि का आकलन 48 घंटे इनक्यूबेशन किया गया था ताकि साइडोफोर अलगाव पर जीनोटाइप और नमूना प्रकार के प्रभाव का निर्धारण किया जा सके। थोक मिट्टी के नमूनों में साइडरोखोर गतिविधि अपेक्षाकृत कम थी और गेहूं जीनोटाइप के बीच अंतर प्रदर्शित नहीं किया गया था जिसमें से थोक मिट्टी का नमूना लिया गया था।
हालांकि, 725 जीनोटाइप से अलग मिट्टी के संवर्धन ने मैडसेन और 727 से शिथिल बंधी मिट्टी की तुलना में अधिक साइडरोफोर उत्पादन का प्रदर्शन किया लेकिन लेवेन से नहीं। इसके विपरीत, कसकर बंधे मिट्टी से संवर्धन में साइडरोफोर उत्पादन जीनोटाइप से भारी प्रभावित नहीं था। अनाज ऊतक की संवर्धन संस्कृतियों में जीनोटाइप की परवाह किए बिना अपेक्षाकृत कम साइडरोपोर उत्पादन हुआ।
लेवेन शूट ऊतक के संवर्धन में अन्य जीनोटाइप की तुलना में काफी कम साइडरोफोर उत्पादन था, और 725 शूट ऊतक संस्कृतियों के परिणामस्वरूप अधिक चर साइडरोफोर उत्पादन हुआ। साइडरोखोर गतिविधि में सबसे बड़ा अंतर रूट ऊतक संवर्धन संस्कृतियों में देखा गया जहां 725 में अन्य सभी जीनोटाइप की तुलना में 200% से अधिक साइडरोपोर गतिविधि थी। प्रोटोकॉल को निष्पादित करने के सबसे अधिक कर लगाने वाले पहलुओं में से एक कैस आयरन अगर माइक्रोप्लेट उत्पन्न करने और साइडरोपोर गतिविधि के लिए नमूनों का परीक्षण करने के लिए कई चरणों को पूरा करते हुए एसेप्टिक स्थितियों को बनाए रखना है।
क्रोमेग्राफिक संस्कृति आधारित या डीएनए-आधारित तकनीकों की एक विस्तृत सरणी को वास्तविक माइक्रोटिटर पर अच्छी तरह से लागू किया जा सकता है या आगे जैव रासायनिक परीक्षणों या आनुवंशिक लक्षण वर्णन और मेटाबोलिक मॉडलिंग के लिए ग्लाइसरोल संरक्षित संस्कृति। इस प्रोटोकॉल साइडरोखोर गतिविधि का उपयोग करके बाद में उस गतिविधि के लिए जिम्मेदार विशिष्ट जीवों के साथ जोड़ा जा सकता है या बाद में बड़े पारिस्थितिक प्रभावों के लिए एक तंत्र के रूप में लक्षित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को आसानी से हवा, पानी और तलछट सहित अन्य पर्यावरणीय डिब्बों से एकत्र किए गए नमूनों से उत्पन्न संवर्धन संस्कृतियों में साइडोखोर उत्पादन का आकलन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
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