Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En roman mänskliga epitelceller Enteroid modell för nekrotiserande enterokolit
Summary April 10th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Enteroids växer fram som en ny modell i studiet av mänskliga sjukdomar. Protokollet beskrivs hur du simulerar en enteroid modell av mänskliga nekrotiserande enterokolit använder lipopolysackarid (LPS) behandling av enteroids genereras från neonatal vävnad. Insamlade enteroids påvisa inflammatoriska förändringar besläktad med de som setts hos människa nekrotiserande enterokolit.
Transcript
Enteroider är tredimensionella organoider som härrör från tarmepitetelceller. De är idealiska för studier av komplexa fysiologiska interaktioner, cell signalering, och värd patogen försvar. Vårt protokoll beskriver hur man kultur mänskliga enteroids efter isolera intestinala stamceller från patienter som genomgår tarm samband.
Samadministration av lipopolysackarid i vår kultur media orsakar en inflammatorisk svar i enteroids leder till histologic, genetiska och protein expression ändringar som liknar de som ses i mänskliga necrotizing enterocolitis. Med tanke på att studiet av necrotizing enterocolitis och potentiella terapeutiska agenter är etiskt utmanande i mänskliga ämnen, särskilt barn, är det mycket önskvärt att utnyttja denna roman, biologiskt relevant enteroid modell av necrotizing enterokolit med hjälp av mänskliga neonatal vävnad. Den största fördelen med denna teknik är att enteroids har möjlighet att rekapitulera de flera celler typer av mänskliga intestinala epitel och har möjlighet att övervinna de erkända begränsningar av djurmodeller och cellbaserade system.
Att hjälpa till att visa förfarandet kommer att Christie Buonpane, en kirurgisk bosatt, och Carrie Yuan, en laboratorietekniker från vårt laboratorium. Vid tidpunkten för insamling i den operativa sviten, placera den mänskliga små tarmvävnad prov i kalla DPBS. Tvätta exemplaret i den kalla DPBS tills det är klart av blod och avföring.
Förvara exemplaret i RPMI 1640 medium vid fyra grader Celsius tills det är klart för kryptisolering. När du är redo att fortsätta, kontrollera igen att provet är klart från avföring och blod. Använda känsliga dissekera saxar bort eventuella överflödigt fett eller kirurgiska klipp och häftklamrar.
Vikta preparatet och sikta på en bit som är ungefär 0,75 till 2,5 gram. Därefter skär vävnaden i 0,5 centimeter bitar och placera dem i ett rör som innehåller 30 milliliter kelatbuffert nummer ett. Skaka i låg hastighet i 15 minuter vid fyra grader Celsius.
Filtrera sedan vävnaden genom en 100 mikrometercellsil och kasta flödet igenom. Tillsätt den filtrerade vävnaden i ett rör som innehåller 30 milliliter kelatbuffert nummer två. Skaka i låg hastighet i 15 minuter vid fyra grader Celsius.
Filtrera vävnaden genom ett 100-mikrometerfilter och kassera flödet genom. Efter detta tina 500 mikroliter av källaren membran matris på is för senare användning. Tillsätt lite vävnad till 10 milliliter kall DMEM i en 50 milliliter koniska rör och skaka kraftigt för hand i 10 sekunder.
Filtrera denna suspension genom en 100 mikrometer cell sil och samla flödet genom. Håll det här röret på is. Tillsätt lite vävnad till ytterligare 10 milliliter kall DMEM i en separat 50 milliliter koniska röret och skaka kraftigt för hand i 10 sekunder.
Filtrera denna suspension genom en 100 mikrometer cell sil och samla flödet genom. Upprepa processen ytterligare två gånger tills det finns fyra koniska rör som innehåller flöde genom märkta en till fyra. Filtrera sedan lösningen i rör nummer ett genom en 100 mikrometer cell sil och överföra flödet genom i en 15 milliliter koniskt rör också märkt nummer ett.
Upprepa denna process för rör två till fyra. Centrifugera de 15 milliliter rören vid 200 gånger G och vid fyra grader Celsius i 15 minuter. I laminär flödeshuven tar du bort supernatanten från varje rör och kasserar den.
Undvik att störa molnet av vävnad omedelbart ovanför pelleten, även om det innebär att lämna några supernatant bakom. I varje rör, pipettera upp och ner långsamt för att blanda pelleten med överblivna supernatant. Överför blandningen från varje rör till ett enda två milliliter koniskt rör och centrifug vid 200 gånger G och vid fyra grader Celsius i 20 minuter.
Efter detta, ta bort supernatanten och resuspend pelleten i 500 mikroliter av pre-tinade källaren membran matris. Använd en kyld pipettspets för att applicera 50 mikroliter av denna suspension till mitten av en brunn i en 24 brunnsplatta. Detta prov bör visas kupol formad.
Upprepa denna ansökningsprocess nio gånger för att fylla 10 totalt brunnar. Överför 24 brunnsplattan till en 5%koldioxidinkubator vid 37 grader Celsius i 30 minuter för att möjliggöra polymerisering. Sedan, tillsätt 500 mikroliter av mänskliga minigut media komplett till varje brunn.
Fortsätt inkubera under samma förhållanden, se till att ersätta detta media varannan dag. Först, tillsätt 10 mikroliter LPS vid en koncentration av fem milligram per milliliter till 500 mikroliter av mänskliga minigut media komplett i varje brunn av plattan på dag noll. Fortsätt inkubera vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid och byt ut de kompletterade medierna varannan dag fram till samlingen.
För att förbereda för paraffininbäddning, ta först försiktigt bort media, tillsätt en milliliter PBS, och försiktigt pipettera upp och ner för att lösa upp källaren membranmatrisen samtidigt som man är noga med att inte lysa enteroiderna. Centrifug med en hastighet som är mindre än 300 gånger G i fem minuter till pelleten och ta sedan bort PBS. Tillsätt 4%paraformaldehyd och ställ röret åt sidan i en timme för att fixera vid rumstemperatur.
Centrifugera med en hastighet som är mindre än 300 gånger G i fem minuter till pelleten och sedan avlägsna paraformaldehyden. Tvätta försiktigt med en milliliter PBS och centrifug med en hastighet som är mindre än 300 gånger G i fem minuter. Ta sedan bort PBS.
Upprepa denna tvättprocess med PBS en gång. Placera önskad mängd av vävnadsbearbetningsgelen i ett koniskt rör och värm den i ett torrt bad inkubator på 65 grader Celsius i tre till 10 minuter tills det är flytande. Efter detta, tillsätt den smälta vävnad bearbetning gel till pelleten och blanda försiktigt.
Placera en liten kloningsring i en täckplatta. Pipettera vävnadsbehandlingsgelen och enteroidblandningen i kloningsringen som monteras på ett täckskydd. Låt vävnadsbearbetningsgelen och den enteroida blandningen stelna vid fyra grader Celsius i en timme.
Därefter, dränka kloning ringen med stelnat blandningen i 70%etanol för att förbereda för paraffin inbäddning. Omedelbart efter plätering, de nyligen isolerande tarmkrypter visas som långsträckta stavar. Inom några timmar kommer enteroiderna att ta på ett runt utseende.
Under de närmaste dagarna kommer enteroiderna att börja bilda sfärer. Knoppning bör ske mellan fem till 10 dagar, vilket är när enteroid insamling bör ske. De växande enteroiderna uppvisar också polaritet, som innehåller en centraliserad lumen, en apikisk gräns och en basilateral domän.
Enteroids visar också strukturell integritet representeras av en robust aktin cytoskelett. Efter flera dagar i kultur, lbs behandlade enteroids uppleva mer apoptos och har en lägre avkastning än kontrollgruppen. Som ses i mänskliga NEC i murin modeller av NEC, ett ökat uttryck för vägtull som receptor fyra finns i LPS behandlade enteroids jämfört med kontroller.
Enteroiderna kan också samlas in för RNA och protein extraktion med hjälp av väl etablerade qRT-PCR och västra blotting tekniker genuttryck och protein isolering kan utföras.
Related Videos
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
