Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Pasient-avledet Orthotopic Xenograft modeller for Human Urotelialt Cell kreft og tykktarmskreft tumor vekst og spontan metastasering
Chapters
Summary May 12th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokollen beskriver generering av pasient-avledet orthotopic xenograft modeller av intra-vesically instilling høyverdig urotelialt celle kreftceller eller intra-rektalt injisere tykk kreftceller i ikke-overvektige diabetiker/alvorlig kombinert immunsvikt (NOD/SCID) mus for primær tumor vekst og spontan metastaser under påvirkning av lymfeknuter stromal celler, som etterligner progresjon av menneskelige metastatisk sykdommer.
Transcript
Modeller er nødvendig for å konsekvent nødvendig for å etterligne kreft metastase gjennom samspillet med lymfeknuter. Hos pasienter med både kolorektal kreft og urothelial cellekreft i blæren. Våre ortotopiske xenografiske modeller som er beskrevet i dette papiret, kan bidra til å besvare disse viktige biologiske spørsmålene og teste nye terapier effektivt og på en klinisk relevant måte.
Våre ortotopiske xenograft svulster produsert i mus ligner pasientens svulst. I nærvær av lymfeknute stromal celler begge modellene har en høyere tumor implantasjon og fjerne organ metastase priser og steder som etterligner menneskelige metastatiske mønstre. Begge dyremodellene har også null prosessuell dødelighet.
Etter å ha fjernet pasientens avledede svulster fra eutaniserte mus, bruk steril kirurgisk saks for å hakke luciferase positive tumorstykker så små som mulig i en petriskål under en laminær strømningshette. Overfør svulstbitene til et sterilt konisk rør på 50 ml. For å forberede fordøyeløsning, tilsett 10 ml kollagnase type 4, 80 mikroliter hyaluronidase og 160 mikroliter deoksyribonukleær type 1 til 40 ml HBSS og bland ved invertering.
Tilsett 35-40 ml av fordøyeløsningen til hakket svulst og inkuber ved 37 grader Celsius med kontinuerlig rotasjon i 2 timer med periodisk kraftig risting. For å fjerne rusk etter fordøyelsen, filtrer den fordøyde svulsten gjennom sterilt 100 mikrometercellesil, etterfulgt av filtrering gjennom en 40 mikrometercellesil som sparer strømmen gjennom i et 50 ml rør hver gang og kaster ruskene. For å vaske frie celler, tilsett 20 ml HBSS til strømmen gjennom og sentrifuge ved 329 ganger tyngdekraften i 5 minutter.
Aspirer den overnaturante og resuspend pellet i 30 ml HBSS. Overfør 100 000 tumorceller til et sterilt konisk rør på 15 ml og tilsett 300 000 tidligere forberedte friske HK-celler. Sentrifuger cellene ved 329 ganger tyngdekraften i 5 minutter og kast supernatanten ved aspirasjon.
Bruk cellene på nytt i komplett RPMI-medium og hold på isen til de er klare til bruk. For å forberede dyret for UCC celle injeksjon bruk hårfjerning krem for å barbere korsryggen av en 6-8 uker gammel kvinnelig NOD-SCID mus. For å administrere UCC-celler i en blære, først sette opp en monopol elektrocautery maskin til en effekt på 4 watt.
Etter å ha bedøvet musen, plasser den i liggende stilling med snuten i en isoflurannesekjegle og bar rygg godt jordet på en spredt elektrode. Smør et 24 gauge angiocatheter med smøregelé og sett deretter angiocatheter forsiktig, men fast gjennom museurinrøret. Hvis kateteret bøyer seg ved inntreden, setter du ledevaieren halvveis inn i kateteret for å gi stabilitet.
Deretter setter du inn den 0,64 millimeter faste kjernelinjen 1 millimeter forbi slutten av angiocatheteren. Hold monopolstiften til ledevaieren i ett sekund, slik at det er en elektrisk irritasjon av blæreslimhinnen. Fest et friskt, sterilt angiocatheter til 1 ml leurlåssprøyte og trekk opptil 200 mikroliter UCC-celler tilberedt i tidligere trinn.
Fjern føringsledningen og angiocatheter fra urinrøret og sett deretter angiocatheter med sprøyte av celler festet til den. Injiser 50 mikroliter av cellene til museblæren og for å la cellene holde seg til blæreveggen, vent noen sekunder før du fjerner angiocatheter. Til slutt fjerner du musen fra isoflurannesekjegl og jordingspute og observerer den i 1 time etter prosedyre for tegn på nød.
For å lage CRC-musemodell plasserer du en bedøvet 6-8 uker gammel hann NOD-SCID-mus i liggende stilling under et dissekerende mikroskop som fester snuten til og isofluranneseglen og de fremre lemmer med tape for stabilitet. Plasser et lite objekt, for eksempel en liten gasbindseksjon under bunnen av halen som løfter anusen for å forbedre visabilitet og vinkel. Bruk buede smurte stumpe spisse tang for å utvide analkanalen og eksponere den distale anal- og rektal slimhinnen og fjerne avføring.
Koble en steril 30 gauge avtagbar nål til en 50 mikroliters glasssprøyte. Tegn 10 mikroliter av tumor- og HK-celler cellesuspensjon tilberedt i tidligere trinn inn i sprøyten. Injiser de 10 mikroliterene i den distale bakre rektal submucosa 1-2 millimeter over analkanalen, og pass på at du ikke passerer inn i bekkenhulen.
Til slutt fjerner du musen fra isofluranneseglen og observerer den i en time etter prosedyre for tegn på nød. Å ukentlig overvåke den primære svulsten, leveren og lunge metastatisk byrde i enten musemodell, først, veie musen. Injiser 150 mg/kg luciferin intra-peritonealt og vent 5 minutter på at substratet sirkulerer i kroppen.
Plasser den bedøvede musen i et bioluminescerende bildesystem med nese festet i nesekjegle, og sørg for at interesseområdet, som er dyrets ventrale side, vender mot kameraet for hvert bilde. Bildemus i liggende posisjon ukentlig for luciferase aktivitet. Etter kutting og farging parafin-innebygd isolert vev, observere dem ved hjelp av et kraftig mikroskop.
I UCC-musemodellen genererte 83,3 prosent av dyrene primære svulster og viste tidsavhengig primær tumorvekst basert på ukentlige bioluminescensmålinger. I CRC-musemodellen vokste 96,9 % av musene primærsvulster. Avhengig av pasientens svulst hadde mussvulstvekst en annen ventetid, noe som gjenspeiler forskjellen i pasientenes kliniske egenskaper.
I både intra-vesikkel og intra-rektal modeller genererte tumorcelleinjeksjon ortotopiske primære svulster. Videre utviklet henholdsvis 33,3% og 53,1% av musene innpodet med UCC-celler og CRC-celler med HK-celler, fjern organmetastase. Histopatologi av xenografts i UCC-modellen ble sammenlignet med primær pasientblærekarsinom.
Fargeresultatene fra xenografts var lik de i de opprinnelige kirurgiske biopsiene, som bekrefter lignende vevsmorfologi. Antistoff til Ki67, en menneskelig celleproliferasjonsmarkør, viser positiv kjernefysisk farging som indikerer svært voksende, raskt voksende menneskelige tumorceller. På samme måte, i CRC-modellen, indikerer H&E-farging likheten av arkitektur mellom xenografts og pasientsvulster.
Antistofffarging mot cytokeratin 20 viste også lignende tumorvekstmønster i begge CRC-modellene. Nøkkelen til disse prosedyrene er å behandle dyrene forsiktig, men fast. Øv med en stødig hånd er den beste måten å utføre disse teknikkene trygt og oppnå de beste resultatene.
Når disse modellene er laget, kan flere forskjellige former for kreftbehandling testes, inkludert kombinasjoner av nåværende legemidler samt nyutviklede behandlinger før kliniske studier hos pasienter. Det er viktig å huske at håndteringen av både kreftceller og nåler skal utføres av erfarne personell for deres sikkerhet, samt for å oppnå optimale resultater.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
