Biochemistry
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血管紧张蛋白II图解的硝酸分析与鉴定
Chapters
Summary June 16th, 2019
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由于三硝基酪氨酸修饰的丰度较低,酪氨酸硝酸蛋白的蛋白组谱分析一直是一项具有挑战性的技术。在这里,我们描述了一种利用血管紧张蛋白II作为模型来增强和分析硝基肽扩脂的新方法。此方法可以扩展到其他体外或体内系统。
Transcript
这一信息可以帮助回答有关如何通过化学方法和质谱法丰富和识别硝基肽的关键问题。该技术具有增强的灵敏度，通过质谱法检测硝基肽，可应用于体外生化系统和内源生物组织。对于硝基血管紧张素 II 脱盐，使用一毫升移液器预置反相固相萃取或 SPE 柱，在柱顶部添加 500 微升甲醇和 500 微升水。
当所有水都流过柱时，将410微升的硝基血管紧张素II溶液加载到柱子上。用500微升5%甲醇和水和300微升80%甲醇和水清洗该柱，以洗涤硝基肽。然后在室温下默认设置下通过速度真空干燥洗水器。
对于原发胺烷基化，在100微升100毫摩尔三聚氨酯碳酸氢盐溶液中重组粉状硝基-血管紧张素II，并在烟罩中加入400微升4%甲醛，并短暂混合。接下来，在溶液中加入四升0.6摩尔氰酸氢钠，在室温下以每分钟400次旋转摇动一小时。在孵育结束时，用16微升1%氨溶液在室温下淬火5分钟，然后用8微升的甲酸化。
然后像刚才演示的，在新的反向阶段 SPE 列中脱盐解决方案。为了减少硝基酪氨酸，在PBS的500微升中重组二甲基标记的硝基-血管紧张素II，并加入10微升的一种摩尔二硫化钠，在室温下孵育一小时。还原反应后，黄色溶液将变得清晰。
如所示，在新的反向相 SPE 列中对减少的样品进行脱盐。在生物素化和富集方面，在PBS的500微升中重组二甲基标记的氨基氨基苯二，然后加入5微升40纳米摩尔NHS-S-S生物素溶解在二甲基硫化物中，在室温下孵育两小时。在孵育结束时，用一个微升5%羟基胺的解毒反应，在100微升的Streptavidin Agarose珠中加入500微升，通过三个独立的离心平衡。
最后一次离心后，在反应系统中加入100微升珠，在室温下在旋转摇床上孵育一小时。在孵化结束时，每次洗涤用500微升新鲜PBS清洗系统四次，然后添加400微升10毫摩尔二十醚，在50摄氏度下孵育45分钟。在孵化结束时，向下旋转柱，将上经器转移到一个含有20微升0.5摩尔碘多乙酰胺的新管中，在黑暗中孵育20分钟。
然后，如演示的新的逆相SPE柱中脱盐溶液，并在20微升0.1%甲酸中解除干肽。为了检测，请将产品装载到带串联质谱仪的液色谱仪上。使用与高分辨率质谱仪直接连接的纳米高压液相色谱系统，以每分钟 0.3 微升的流速将经过改进的血管紧张素 II 肽分离 60 分钟梯度 elusion。
在数据依赖采集模式下，在质谱仪中设置单个全扫描质量谱，然后以 28% 的规范化碰撞能量进行 20 次数据依赖串联质谱扫描。然后打开质谱数据，确定每个步骤中产品的峰值，以确认化学反应已成功执行。在这里，可以观察到血管紧张素II在每次化学修饰之前和之后具有代表性的质谱。
该化合物的分子量由单同位素峰的电量比值表示，表明该步骤成功实现了血管紧张素II的化学修饰。在这里，通过串联质谱法检测和描述的液相色谱的最终产品。通过二甲基标记对硝基肽进行定量分析，通过比较每组单同位素峰值的强度，可以计算轻和重的相对量，从而可以量化不同组富集的硝基肽。
按照该过程，您可以使用程序搜索引擎，如SEQUEST最大计数的pFIND，以确定潜在的硝基肽。该技术开发后，为开始特定硝化场的生物功能铺平了道路。
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