Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II
Chapters
Summary June 16th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Proteomic profilering van tyrosine-nitraat eiwitten is een uitdagende techniek vanwege de geringe overvloed van de 3-nitrotyrosine modificatie. Hier beschrijven we een nieuwe aanpak voor nitropeptide verrijking en profilering met behulp van angiotensine II als model. Deze methode kan worden uitgebreid voor andere in vitro -of in vivo -systemen.
Transcript
Dit bericht dat kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over hoe nitropeptiden te verrijken en te identificeren door middel van een chemische aanpak en de massaspectrometrie. Deze techniek heeft een verbeterde gevoeligheid voor het detecteren van nitropeptiden door massaspectrometrie en die kan worden toegepast op zowel in vitro biochemische systemen als endogene biologische weefsels. Voor nitro-angiotensine II desalting, gebruik een één milliliter pipet om een omgekeerde fase vaste-fase extractie of SPE kolom met de toevoeging van 500 microliters van methanol en 500 microliter water in de bovenkant van de kolom te conditioneren.
Wanneer al het water door de kolom is gelopen, laadt u 410 microliter nitro-angiotensin II-oplossing op de kolom. Was de kolom met 500 microliter van 5% methanol en water en 300 microliter van 80% methanol en water om het nitropeptide te ontwijken. Droog vervolgens het eluaat door snelheidvacuüm in de standaardinstelling bij kamertemperatuur.
Voor primaire aminealkylation reconstitueert u de nitro-angiotensin II in poedervorm in 100 microliter van 100 millimolar Triethylammonium bicarbonaatoplossing en voeg 400 microliter van 4% formaldehyde toe aan de oplossing in een rookkap met korte menging. Voeg vervolgens vier microliters van 0,6 molaire natriumcyanoborohydride toe aan de oplossing met schudden met 400 rotaties per minuut gedurende een uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, blus de etiketteringsreactie met 16 microliters van 1%ammoniakoplossing gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door verzuring met acht microliters mierenzuur.
Dan desalt de oplossing in een nieuwe omgekeerde fase SPE kolom zoals net aangetoond. Voor nitrotyrosine om aminotyrosinereductie te verminderen, reconstrueren de dimethyl-gelabelde nitro-angiotensin II in 500 microliterten van PBS en voeg 10 microliter van een molaire natriumdithionaat voor een uur incubatie bij kamertemperatuur. Na de reductiereactie wordt de gele oplossing duidelijk.
Desalt de verminderde steekproef in een nieuwe omgekeerde fase SPE kolom zoals aangetoond. Voor biotinylation en verrijking reconstrueren we de aminoangiotensin II met dimethyllabel in 500 microliter pbs, gevolgd door de toevoeging van vijf microliter van 40 nanomolar NHS-S-S-biotine opgelost in dimethylsulfoxide voor een twee uur durende incubatie bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, blus de reactie met een microliter van 5% hydroxylamine en voeg 500 microliter verse PBS toe aan 100 microliter van Streptavidin Agarose kralen voor het evenwicht door drie afzonderlijke centrifugaties.
Voeg na de laatste centrifugatie 100 microliter kralen toe aan het reactiesysteem voor een incubatie van een uur op een Rotary Shaker bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie was het systeem vier keer met 500 microliters verse PBS per wasbeurt, gevolgd door de toevoeging van 400 microliters van 10 millimolar dithiothreitol voor een incubatie van 45 minuten bij 50 graden Celsius. Draai aan het einde van de incubatie de kolom af en breng de supernatant over in een nieuwe buis met 20 microliter van 0,5 molaire iodoacetamide gedurende een incubatie van 20 minuten in het donker.
Dan desalt de oplossing in een nieuwe omgekeerde fase SPE kolom zoals aangetoond en het oplossen van de droge peptide in 20 microliters van 0,1%mierenzuur. Laad het product voor detectie op een vloeibare chromatograaf met een tandemmassaspectrometer. Scheid de gemodificeerde angiotensine II peptiden door een 60 minuten gradiënt elusion met een stroomsnelheid van 0,3 microliter per minuut met het nanohogedrukvloeistofchromatografiesysteem dat direct is verbonden met de massaspectrometer met hoge resolutie.
Stel in de gegevensafhankelijke acquisitiemodus één volledig scanmassaspectrum in de massaspectrometer in, gevolgd door 20 dataafhankelijke tandemmassaspectrometerscans bij 28% genormaliseerde botsenergie. Open vervolgens de massaspectragegevens en identificeer de pieken van het product in elke stap om te bevestigen dat de chemische reactie met succes is uitgevoerd. Hier kan representatieve massaspectra van angiotensin II voor en na elke chemische wijziging zoals aangetoond worden waargenomen.
Het molecuulgewicht van de verbinding wordt aangegeven door de massa-ladingsverhoudingwaarden van de mono-isotopenpiek, wat aangeeft dat de chemische modificatie op angiotensine II met succes voor die stap is bereikt. Hier wordt het eindproduct zoals gedetecteerd en gekenmerkt door vloeibare chromatografie met tandemmassaspectrometrie getoond. Kwantitatieve analyse van de nitropeptiden door dimethyl-etikettering maakt het mogelijk om de relatieve hoeveelheden licht en zwaar te berekenen door de intensiteit van de mono-isotopenpiek in elke groep te vergelijken, waardoor de verrijkte nitropeptiden uit verschillende groepen kunnen worden gekwantificeerd.
Na de procedure u een programmazoekmachine gebruiken, zoals het maximum aantal vastleggingen van pFIND om de potentiële nitropeptiden te identificeren. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor het starten van de biologische functies van specifieke nitrantsoenplaatsen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
