Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני
Chapters
Summary June 16th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
פרופיל פרוטאומומית של טירולך-nitrated חלבונים כבר טכניקה מאתגרת בשל השפע הנמוך של שינוי 3-ניטרוטירולי. כאן אנו מתארים גישה מקורית להעשרה וליצירת פרופילים של ניטרוגליצרין באמצעות אנגיוטנסין II כמודל. שיטה זו ניתנת להארכה עבור אחרים בתחום החוץ הגופית או במערכות vivo .
Transcript
הודעה זו שיכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על איך להעשיר ולזהות nitropeptides על ידי גישה כימית ספקטרומטריית המסה. טכניקה זו יש רגישות משופרת לגילוי nitropeptides על ידי ספקטרומטריית מסה וזה יכול להיות מיושם הן במערכות ביוכימיות במבחנה ורקמות ביולוגיות אנדוגני. עבור התפלה nitro-angiotensin II, להשתמש צינור מיליליטר אחד כדי precondition מיצוי בשלב הפוך מוצק שלב או עמוד SPE עם תוספת של 500 microliters של מתנול ו 500 microliters של מים לתוך החלק העליון של העמוד.
כאשר כל המים עברו דרך העמוד, לטעון 410 microliters של פתרון ניטרו אנגיוטנסין II על העמוד. שטפו את העמוד עם 500 מיקרוליטרים של 5%מתנול ומים ו-300 מיקרוליטרים של 80% מתנול ומים כדי לחמק מהניטרופיפטיד. לאחר מכן ייבשו את ה-eluate על ידי ואקום מהירות בהגדרת ברירת המחדל בטמפרטורת החדר.
לקבלת אלקילציה אמין ראשוני, reconstitute אבקת ניטרו אנגיוטנסין II ב 100 microliters של 100 מילימולארי Triethylammonium bicarbonate פתרון ולהוסיף 400 microliters של 4% פורמלדהיד לפתרון במכסה המנוע אדים עם ערבוב קצר. לאחר מכן, להוסיף ארבעה microliters של 0.6 נתרן טוחן cyanoborohydride לפתרון עם רועד ב 400 סיבובים לדקה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מרווה את תגובת התיוג עם 16 מיקרוליטרים של תווי אמוניה 1% במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ואחריו חומציות עם שמונה מיקרוליטרים של חומצה פורמית.
לאחר מכן התפל את הפתרון בעמודת SPE הפוכה חדשה כפי שהוכח זה בלבד. עבור הפחתת ניטרוטירוסין אמינוטירוסין, מחדש את דימתיל שכותרתו ניטרו אנגיוטנסין II ב 500 microliters של PBS ולהוסיף 10 microliters של נתרן דיתיונט אחד דיתיונט טוחן עבור דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר תגובת ההפחתה, הפתרון הצהוב יתבהר.
התפל את הדגימה המופחתת בעמודת SPE הפוכה חדשה כפי שהוכח. עבור ביוטינילציה והעשרה, reconstitute אמינואנגיוטנסין II שכותרתו דימתיל ב 500 microliters של PBS ואחריו תוספת של חמישה microliters של 40 ביוטין NHS-S-S ננו-מולאר מומס דימתיל סולפוקסיד עבור דגירה של שעתיים בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מרווה את התגובה עם מיקרוליטר אחד של 5%hydroxylamine ומוסיפים 500 מיקרוליטרים של PBS טרי ל -100 מיקרוליטרים של חסידי סטרפטבידין אגרוז לשווי משקל בשלוש צנטריפוגות נפרדות.
לאחר הצנטריפוגה האחרונה, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של חרוזים למערכת התגובה עבור דגירה של שעה על שייקר רוטרי בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את המערכת ארבע פעמים עם 500 microliters של PBS טרי לכל לשטוף ואחריו תוספת של 400 microliters של 10 dithiothreitol מילימול במשך 45 דקות דגירה ב 50 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לסובב את העמוד ולהעביר את supernatant לתוך צינור חדש המכיל 20 microliters של 0.5 molar iodoacetamide עבור דגירה 20 דקות בחושך.
לאחר מכן התפל את הפתרון בעמודת SPE הפוכה חדשה כפי שהוכח ולפתור את הפפטיד היבש ב 20 microliters של 0.1% חומצה פורמית. לגילוי, לטעון את המוצר על כרומטוגרף נוזלי עם ספקטרומטר מסה דו-מושבית. הפרד את הפפטידים האנגיוטנסין II ששונו על ידי 60 דקות של תבליט הדרגתי בקצב זרימה של 0.3 מיקרוליטרים לדקה עם מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית בלחץ ננו-גבוה המתממשקת ישירות עם ספקטרומטר המסה ברזולוציה גבוהה.
במצב רכישה תלוי נתונים, הגדר ספקטרום מסת סריקה מלא יחיד בספקטרומטר המסה, ואחריו 20 סריקות ספקטרומטר מסה דו-מושבית תלויות נתונים ב- 28% אנרגיית התנגשות מנורמלת. לאחר מכן פתח את נתוני ספקטרום המסה וזהה את פסגות המוצר בכל שלב כדי לאשר שהתגובה הכימית בוצעה בהצלחה. כאן, ספקטרום מסה מייצג של אנגיוטנסין II לפני ואחרי כל שינוי כימי כפי שהוכח ניתן לראות.
המשקל המולקולרי של המתחם מסומן על ידי ערכי יחס מסה לטעינה של פסגת האיזוטופ מונו, המציין כי השינוי הכימי על אנגיוטנסין II הושג בהצלחה עבור שלב זה. כאן, המוצר הסופי כפי שזוהה ומאופיין כרומטוגרפיה נוזלית עם ספקטרומטריית מסת טנדם מוצג. ניתוח כמותי של הניטרופיפטידים על ידי תיוג דימתיל מאפשר חישוב של הכמויות היחסיות של אור וכבד באמצעות השוואה של עוצמת פסגת האיזוטופ המונו בכל קבוצה, ומאפשר כימות של הניטרופיפטידים המועשרים מקבוצות שונות.
בעקבות ההליך, באפשרותך להשתמש במנוע חיפוש תוכנית כגון הספירה המרבית SEQUEST של pFIND כדי לזהות את nitropeptides הפוטנציאלי. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך להתחלת הפונקציות הביולוגיות של אתרי חנקן ספציפיים.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
