Summary

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Published: June 16, 2019
doi:

Summary

פרופיל פרוטאומומית של טירולך-nitrated חלבונים כבר טכניקה מאתגרת בשל השפע הנמוך של שינוי 3-ניטרוטירולי. כאן אנו מתארים גישה מקורית להעשרה וליצירת פרופילים של ניטרוגליצרין באמצעות אנגיוטנסין II כמודל. שיטה זו ניתנת להארכה עבור אחרים בתחום החוץ הגופית או במערכות vivo .

Abstract

ניטרציה חלבון היא אחת השינויים החשובים ביותר פוסט-translational (ptm) על שאריות טירוזין וזה יכול להיגרם על ידי פעולות כימיות של מינים חמצן תגובתי (ROS) ו מינים חנקן תגובתי (rns) בתאי איקריוטית. זיהוי מדויק של אתרי ניטרציה על חלבונים הוא חיוני להבנת התהליכים הפיזיולוגיים והפתולוגיים הקשורים לניטרציה חלבונים, כגון דלקת, הזדקנות וסרטן. מאז החלבונים הנידורגים הינם בעלי שפע נמוך בתאים, אפילו בתנאים המושרה, לא פותחו שיטות אוניברסליות ויעילות ליצירת פרופיל וזיהוי של אתרי חלבון נימזון. כאן אנו מתארים פרוטוקול להעשרה ניטרוניות באמצעות תגובת הפחתת כימית ותיוג ביוטין, ואחריו ברזולוציה גבוהה ספקטרומטר מסה. בשיטה שלנו, נגזרות של ניטרופפטיד יכול להיות מזוהה עם דיוק גבוה. השיטה שלנו מציגה שני יתרונות בהשוואה לשיטות שדווחו קודם לכן. ראשית, תיוג diמתיל משמש כדי לחסום את האמין העיקרי על ניטרופפטידים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ליצור תוצאות כמותיים. שנית, קשר דיגואני המכיל את הגידול של מדיקל-ביוטין משמש להעשרה, שיכול להיות מופחת עוד יותר ואלשני כדי לשפר את אות הזיהוי על ספקטרומטר מסה. פרוטוקול זה הוחל בהצלחה על מודל הפפטיד אנגיוטנסין II בעיתון הנוכחי.

Introduction

ניטרציה של שאריות טירולי בחלבונים לטופס 3-ניטרוטירולך מסדיר תהליכים ביולוגיים רבים. בשל התכונות הכימיות השונות בין טירולי ו 3-ניטרוטירולך, חלבון nitrated דורג יכול להיות מודאג הפעילות איתות1,2. לכן, חשוב לפתח שיטות שיכולות להעשיר ולזהות אתרי ניטרציה על חלבונים ביעילות. כמו 3-ניטרוטירולך הוא שינוי שפע נמוך על חלבונים לעומת צורות אחרות של PTM, כגון זרחון ו מרחרחון, זה מאתגר לזהות אתרי נימזון אנדוגני ישירות מקווי התא או דגימות רקמות. עם זאת, המתודולוגיה של שימוש בספקטרומטר מסה (MS) כדי לאפיין את דפוס הפיצול של הנירוטפפטיד פותחה (למשל, Zhan &שלושה), אשר מטילה את הבסיס עבור שיטות חדשות של ניטרונים.

כיום, צעד העשרה ולאחריו MS היא האסטרטגיה החזקה ביותר ליצירת פרופיל באמצעות ניטרופפטיד4,5. ניתן לסווג את שיטות ההעשרה לשתי כיתות. מחלקה אחת מבוססת על נוגדנים שיכולים לזהות 3-ניטרוטירולי במיוחד, בעוד המחלקה האחרת מבוססת על הנגזרת הכימית שמפחית קבוצת ניטרו לקבוצת אמין4,5. עבור השיטה המבוססת על נוגדן, העמודה זיקה של ניטרוטירולך משמשת להעשרה, שממנה החומר החומק נפתר ונותח ברזולוציה גבוהה MS6,7. עבור השיטה המבוססת על נגזרת כימית, הקבוצות של האמין במסוף N-הטרמינוס של הפפטיד או ליזין צריכות להיות חסומות בשלב הראשון על-ידי מרחרחון, תגי איזואוריים לקוונטים יחסיים ומוחלטים (iTRAQ), או משני תגי המסה (מציון). בשלב הבא, כמפחית משמש כדי להקטין את הניטרוטירולטירואל ואחריו שינוי קבוצת האמין החדשה שהוקמה, הכוללת המרה של ביוטין ליזיט, המרת פפטיד sulphydryl, או סוגים אחרים של מערכות תיוג8,9, 10,11. רוב הפרוטוקולים שהוקמו עד כה מבוססים על חלבונים מחוץ למבחנה, במקום חלבונים שאינם מדורגים באופן שורש.

במחקר הנוכחי, הליך שונה של הנגזרת הכימית של ניטרוטירולך מפותח עבור העשרה ניטרוגליצרין וזיהוי, אשר מראה רגישות מוגברת במהלך זיהוי MS והוא מתאים למטרת כימות. המחקר האחרון שלנו העסקת שיטה זו במערכות ביולוגיות זיהה כי ניטרציה של חלבון מסוים לימפוציטים טירולך קינאז (lck) ב Tyr394 על ידי rns המיוצרים מתאי מדכא מיאלואידית נגזר (MDSCs) ממלא תפקיד חשוב ב דיכוי חיסוני של מיקרואקולוגיה של הגידול12. לכן, השיטה שלנו לזיהוי ניטרופפטיד יכולה להיות מוחלת גם על דגימות ביולוגיות מורכבות. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו על ידי שימוש במודל מודל אנגיוטנסין II, אשר דפוס הפיצול ידועה בשימוש נרחב ב ניטרואומומית לימודי8,9,10,11, כדוגמה.

Protocol

1. ניטרציה של אנגיוטנסין II כדי ליצור פפטיד מדורגים, לדלל 10 μL של אנגיוטנסין II (DRVYIHPF) הפתרון ההורה (2 מ”מ במים) ב 390 μL PBS פתרון (10 מ”מ בלבד2פו4, 150 מ”מ הנאל, pH 7.4) בריכוז הסופי של 50 μm. הוסף 10 μL של הפראוקסיניטריט (200 מ”מ ב4.7% NaOH) לפתרון השני של אנגיוטנסין II כדי לבצע את הריכוז הסופי של ?…

Representative Results

תרשים הזרימה ליצירת פרופיל ניטרוגליצרין בכתב יד זה מוצג באיור 1. איור 2, 3, 4 ו- 5 מציגים את הספקטרום ההמוני של אנגיוטנסין ii, ניטרו-אנגיוטנסין Ii, דימתיל-אנגיוטסין ii ו דימתיל, המסומנים בשני אנגיוטנסין, בהתאמה. המשקל המולקולרי של התרכוב…

Discussion

הפרוטוקול מתאר את ההעשרה. והפרופיל של הניטרוגליצרין השימוש באנגיוטנסין II כפפטיד מודל, אנו מומחש את ההליך המוצג באיור 1. לאחר קבלת ניטרו-Angiotensin II, האמין העיקרי על פפטיד צריך להיות חסום כדי למנוע את הקוניוגאמין נוסף, שהוא אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול. בפרוטוקול הנוכחי,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי האגודה האמריקנית לחקר הסרטן מוסדיים IRG-14-195-01 (מ. שרון מחסנית הוא חוקר ראשי; X.L. הוא חוקר נמענים משנה). פרסום זה התאפשר עם תמיכה חלקית מתוך גרנט מספרים KL2 TR002530 ו UL1 TR002529 (א. שחאר, PI) מן המכונים הלאומיים לבריאות, המרכז הלאומי לקידום מדעי העבר, פרס קליני וטרנסלטיל מדעים. X L. הוא המקבל של אינדיאנה KL2 החוקר הצעיר פרס. ס. פ. נתמך על ידי וולטר סרטן הקרן קידום מענקים בסיסיים בסרטן. X. W. נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין התוכנית הכללית (גרנט No. 817773047).

Materials

Acclaim pepmap 100 C18 column Thermo-Fisher 164534
1 M TEAB solution Sigma-Aldrich T7408
50% hydroxylamine Thermo-Fisher 90115
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Molecular Biology Grade
formaldehyde-D2 Toronto Research Chemicals F691353
formic acid Sigma-Aldrich 695076 ACS reagent
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
isoacetamide Sigma-Aldrich I1149
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
NHS-S-S-bition Thermo-Fisher 21441
Oasis HLB column (10 mg) Waters 186000383
peroxynitrite Merck-Millipore 516620
sodium cyanoborohydrite Sigma-Aldrich 42077 PhamaGrade
sodium dithionate Sigma-Aldrich 157953 Technical Grade
Streptavidin Sepharose GE Healcare GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC Thermo

References

  1. Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
  2. Radi, R. Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects. Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).
  3. Zhan, X., Desiderio, D. M. MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin. Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).
  4. Batthyány, C., et al. Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects. Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).
  5. Feeney, M. B., Schöneich, C. Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).
  6. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).
  8. Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides. Talanta. 80, 1503-1512 (2010).
  9. Chiappetta, G., et al. Quantitative identification of protein nitration sites. Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).
  10. Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins. Current Protocols in Protein Science. , (2012).
  11. Zhang, Q., et al. A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples. Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).
  12. Feng, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).
  13. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).

Play Video

Cite This Article
Feng, S., Wen, X., Lu, X. Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II. J. Vis. Exp. (148), e59391, doi:10.3791/59391 (2019).

View Video