Medicine
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वयस्क चूहे से एट्रियल मायोसाइट्स का अलगाव
Summary July 25th, 2019
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इस प्रोटोकॉल एक खंड पाचन दृष्टिकोण का उपयोग वयस्क माउस दिल से एकल atrial cardiomycytes को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस दृष्टिकोण सही को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है या छोड़ दिया atrial मायोसाइट्स कि पैच-क्लंप अध्ययन में एट्रियल मायोसाइट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Transcript
पैच-क्लैंप प्रयोगों में उपयोग के लिए एट्रियल मायोसाइट्स को अलग करने से हमारे ज्ञान को बहुत उन्नत किया गया है और सेलुलर और आणविक दोनों स्तरों पर एट्रियल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को समझना है। दृष्टिकोण हम प्रभावी ढंग से अलग अलिंद मायोसाइट्स की बड़ी संख्या में पैदावार है कि प्रयोगात्मक मॉडल और शर्तों की एक विस्तृत श्रृंखला में सेलुलर अलिंद इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और अतालता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमने एट्रियल मायोसाइट्स को अलग-थलग करने के लिए ट्रंक पाचन दृष्टिकोण अपनाया है ।
इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह शोधकर्ता विशिष्ट क्षेत्र वे जांच करना चाहते है चुनने के लिए अनुमति देता है । पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित उपकरणों और समाधानों की तैयारी के साथ इस प्रक्रिया को शुरू करें। विच्छेदन प्लेट, विच्छेदन उपकरण, एक पाश्चर पिपेट, और आग पॉलिश पिपेट बाहर रखें।
यह प्रोटोकॉल पुरुष या मादा जंगली प्रकार के चूहों, आनुवंशिक उत्परिवर्तनों को ले जाने वाले चूहों और बीमारी के माउस मॉडल पर किया जा सकता है। पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित माउस इच्छामृत्यु के बाद, माउस को कागज के तौलिया या कॉर्क बोर्ड पर रखें और माउस को जगह में पकड़ने के लिए पंजे को टेप करें। 70% इथेनॉल के साथ माउस की छाती गीला।
घुमावदार कैंची का उपयोग करके छाती को कवर करने वाले फर और त्वचा को हटा दें। अगले उरोस्थि उठाने के लिए चूहा दांत संदंश का उपयोग करें और फिर पसलियों के किनारे के साथ डायाफ्राम काटें। दिल को बेनकाब करने के लिए घुमावदार कैंची का उपयोग करके पूरे रिबकेज को हटा दें।
एट्रियल उपांग को हटाने के लिए, धीरे-धीरे बारीक विच्छेदन संदंश का उपयोग करके उपांग उठाएं और इसे वसंत कैंची से काट लें। तुरंत एक सिलिकॉन लेपित विच्छेदन पकवान में एट्रियल उपांग स्थानांतरित करें जिसमें 20 मिलीलीटर गर्म संशोधित टायरोड के पीएच 7.4 समाधान हैं। अलिंद उपांग के उद्घाटन के नीचे एक विच्छेदन पिन और एक पिन रखें।
एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, रक्त को हटाने के लिए गर्म संशोधित टायरोड के पीएच 7.4 समाधान के साथ अटरिया को फ्लश करें। अपने ऊपर और नीचे किनारे के साथ काटने के द्वारा अलिंद उपांग खोलें। इसके बाद, ऊतक का एक फ्लैट आयताकार टुकड़ा बनाने के लिए एट्रियल उपांग के कोनों को पिन करें।
एप्रियल उपांग को वसंत कैंची और ठीक संदंश का उपयोग करके लगभग आठ से 10 बराबर आकार की स्ट्रिप्स में काट लें। ध्यान दें कि स्ट्रिप्स अनुबंध एक बार वे ऊतक के मुख्य टुकड़े से मुक्त काट रहे हैं । छोटे बोर फायर पॉलिश पिपेट का उपयोग करके, ऊतक स्ट्रिप्स को गर्म संशोधित टायरोड के पीएच 6.9 समाधान वाली पहली ट्यूब में स्थानांतरित करें।
पांच मिनट इंतजार करें। अब, ऊतक स्ट्रिप्स को संशोधित टायरोड के पीएच 6.9 समाधान वाले दूसरे दौर तली ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए मध्यम बोर फायर पॉलिश पिपेट का उपयोग करें। ऊतक स्ट्रिप्स को धोने के लिए, पांच मिलीलीटर गोल तली ट्यूब को कैप करें और धीरे-धीरे ट्यूब को तीन बार उलटा करें।
ऊतक स्ट्रिप्स मध्यम बोर आग पॉलिश पिपेट का उपयोग कर तीसरी ट्यूब के लिए ऊतक स्ट्रिप्स स्थानांतरित करने से पहले ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करते हैं। स्ट्रिप्स को फिर से उलटा करके धोएं। फिर, एक मध्यम बोर आग पॉलिश पिपेट का उपयोग करके एंजाइम समाधान में ऊतक स्ट्रिप्स को स्थानांतरित करें और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
टिश्यू स्ट्रिप्स को एक साथ पालन करने से रोकने के लिए हर तीन से पांच मिनट में ट्यूब को चक्कर लगाते हैं। एंजाइमेटिक पाचन की शुरुआत में, ऊतक स्ट्रिप्स घूमता के बाद जल्दी से व्यवस्थित होते हैं। पाचन के लगभग 20 मिनट में, ऊतक स्ट्रिप्स घूमता के बाद एंजाइमेटिक समाधान में तैरने लगते हैं।
इस समय के दौरान, अलिंद ऊतक स्ट्रिप्स भी हल्के गुलाबी से सफेद के रूप में वे पचा रहे हैं उपस्थिति में बदल जाते हैं। एंजाइमेटिक पाचन के बाद, तैयार पांच मिलीलीटर गोल तली ट्यूबों में केबी समाधान के 2.5 मिलीलीटर का उपयोग करके तीन वॉश करें। प्रत्येक धोने के लिए, धीरे से मध्यम बोर आग पॉलिश पिपेट का उपयोग कर अगले ट्यूब के लिए ऊतक ले जाने से पहले तीन बार ट्यूब उलटा ।
अंतिम धोने के बाद, स्ट्रिप्स को 14 मिलीलीटर राउंड तली ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें केबी समाधान के 2.5 मिलीलीटर होते हैं। पांच मिनट इंतजार करें। धीरे-धीरे विस्तृत बोर फायर पॉलिश पिपेट का उपयोग करके 7.5 मिनट के लिए ऊतक को ट्रिट करें।
यह यांत्रिक रूप से ऊतक स्ट्रिप्स को अलग करेगा और व्यक्तिगत एट्रियल मायोसाइट्स से भरा एक बादल समाधान निकलेगा। त्रिचरन के पहले कोशिकाओं को नुकसान के बिना कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या उपज के अनुरूप किया जाना चाहिए। चूहों की उम्र और बीमारी की स्थिति जैसे कारकों पर विचार करें।
व्यापक बोर आग पॉलिश पिपेट से ऊतक स्ट्रिप्स को निष्कासित करने की आवृत्ति और वेग दोनों को बदलकर व्यक्तिगत अलगाव के लिए त्रयण के बल को दर्जी करें। कोमल त्रिturation कम कोशिका उपज में परिणाम है, जबकि कठोर त्रिएशन कई मृत कोशिकाओं निकलेगा। प्रयोगात्मक उपयोग के लिए कोशिकाओं के वांछित घनत्व के आधार पर सात से 10 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा के लिए केबी समाधान के साथ ट्राइसैचुरेटेड ऊतक स्ट्रिप्स युक्त 14 मिलीलीटर दौर तली ट्यूब भरें।
इस ट्यूब को एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रखें। इस इनक्यूबेशन अवधि के बाद, कोशिकाओं को सात घंटे तक के लिए विभिन्न प्रकार के प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है। यहां दिखाया गया है कि सामान्य चूहों से अलग एट्रियल मायोसाइट्स के उदाहरण हैं।
अलग एट्रियल मायोसाइट्स आमतौर पर लंबाई में 100 माइक्रोन और स्पष्ट स्ट्राइशन के साथ चौड़ाई में 10 माइक्रोन के क्रम पर होते हैं। अलग एट्रियल मायोसाइट्स की क्षमता आमतौर पर 40 से 70 पिकोफराड होती है। वर्तमान क्लैंप मोड में छिद्रित पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग करके दर्ज किए गए एट्रियल मायोसाइट एक्शन क्षमता का एक उदाहरण दिखाया गया है।
पैच-क्लैंप तकनीक के पूरे सेल विन्यास में सोडियम धाराओं का एक प्रतिनिधि परिवार दर्ज किया गया था। इन धाराओं नकारात्मक १२० मिलीवोलlts की एक होल्डिंग क्षमता से नकारात्मक १०० और सकारात्मक 10 मिलीवोल्ट्स के बीच ५० मिलीसेकंड वोल्टेज क्लैंप कदम का उपयोग कर दर्ज किए गए । एक सारांश सोडियम वर्तमान वोल्टेज संबंध यहां प्रस्तुत किया जाता है।
कैल्शियम धाराओं का एक प्रतिनिधि परिवार नकारात्मक 70 मिलीवोलlt की होल्डिंग क्षमता से नकारात्मक 60 और सकारात्मक 80 मिलीवोल्ट के बीच 250 मिलीसेकंड वोल्टेज क्लैंप चरणों का उपयोग करके दर्ज किया गया था। एक सारांश कैल्शियम वर्तमान वोल्टेज संबंध यहां प्रदर्शित किया जाता है। पोटेशियम धाराओं का एक प्रतिनिधि परिवार नकारात्मक 120 मिलीवोल्ट और सकारात्मक 80 मिलीवोल्ट्स के बीच 500 मिलीसेकंड वोल्टेज क्लैंप चरणों का उपयोग करके नकारात्मक 80 मिलीवोलlt की होल्डिंग क्षमता से दर्ज किया गया था।
यहां सारांश वर्तमान वोल्टेज संबंध कुल पोटेशियम वर्तमान के लिए दिखाया गया है। यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि एक सफल एट्रियल मायोसाइट अलगाव एक उपयुक्त एंजाइमेटिक पाचन के साथ-साथ त्रिभव के दौरान कोशिकाओं के यांत्रिक विघटन दोनों पर निर्भर करता है। एक बार अलग होने के बाद, एट्रियल मायोसाइट्स का उपयोग पैच-क्लैंप प्रयोगों में कार्रवाई संभावित आकृति विज्ञान और आयनिक धाराओं के मापन के लिए किया जा सकता है, जैसे सोडियम धाराएं, कैल्शियम धाराएं और पोटेशियम धाराएं।
अलिंद मायोसाइट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में परिवर्तन की जांच जीवन के सेलुलर और आणविक आधार का निर्धारण करने के लिए आवश्यक किया गया है अलिंद अतालता की धमकी और विकास और अलिंद अतालता के लिए विरोधी अतालता यौगिकों के परीक्षण के लिए ।
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