Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Eencellige RNA-sequencing en analyse van menselijke pancreatic eilandjes
Chapters
Summary July 18th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier presenteren we een protocol voor het genereren van hoogwaardige, grootschalige transcriptome gegevens van afzonderlijke cellen van geïsoleerde menselijke alvleesklier eilandjes met behulp van een druppel-gebaseerde microfluïdische single-cell RNA sequencing technologie.
Transcript
Dit protocol genereert hoge doorvoertranscriptiegegevens van individuele menselijke eilandjecellen, die kunnen worden gebruikt om anochrome celheterogeniteit te bestuderen, zeldzame celtypes te identificeren en genregulatie bij ziekten. Deze techniek genereert grotere schaal eencellige gegevens, is gemakkelijk te gebruiken, en heeft vrij korte verwerkingstijd. Deze methode kan worden toegepast op eilandjes van andere soorten en om andere vers geïsoleerde weefsels te profileren.
Het protocol moet echter worden geoptimaliseerd om weefselspecifieke dissociatieprocedures aan te passen. Het is van cruciaal belang om gescheiden cellen van hoge kwaliteit voor te bereiden. QC van de celopening voor eencellige partitionering is de sleutel, net als de behandeling van de emulsie zorgvuldig en snel.
Sommige kwaliteit checkpoints zoals weten of een chip verstopt is beter gezien dan gelezen. Na het verkrijgen van menselijke eilandjes en het uitbroeden 's nachts, tellen en met de hand picken 200 tot 300 eilandjes met behulp van een P200 pipet. Breng de eilandjes over op een 15-millimeter conische buis met vijf millimeter volledig eilandje, voorverwarmd tot 37 graden Celsius.
Plaats de buis in een centrifuge op 200 keer G gedurende twee minuten. Voorzichtig aspirate de supernatant zonder verstoring van de pellet op de bodem. Voeg een millimeter voorverwarmde celdissociatieoplossing toe en verstoor de pellet door zachtjes op en neer te pipetten.
Broed de eilandjes negen tot elf minuten in de 37 graden Celsius. Elke drie minuten, pipet op en neer langzaam gedurende 10 seconden om de cellen te scheiden in enkele cellen. Zodra de eilandjecellen goed gescheiden zijn en de oplossing troebel wordt, voeg dan negen milliliter van volledige eilandjes media en filter door een 30-micrometer cel zeef in een nieuwe 15-milliliter conische buis.
Verzamel de cellen door centrifugatie op 400 keer G gedurende vijf minuten. Aspirate de supernatant en opnieuw op te schorten de cel pellet in 200 tot 300 microliter van 1X PBS 04%BSA oplossing. Meng nu 10 microliter van de celkweek met 0,5 microliter AO/DAPI.
Pipet op en neer om grondig te mengen. Laad 10,5 microliter op een dia en voer de celtellingstest uit op een geautomatiseerde celteller op basis van fluorescentie om het aantal en de levensvatbaarheid te bepalen. Plaats een microfluïde chip in een chipcase.
Oriënteer de chipcase, zodat olieputten het dichtst bij de persoon staan die het experiment uitvoert. Gebruik een pipet om het berekende volume van de cellen toe te voegen aan de voorbereide buisstrips. Pipette om vijf keer te mengen.
Zonder de pipettips weg te gooien, breng je 90 microliter celmengsel over om een van de chip te roeien. Wacht 30 seconden, dan pipet heel langzaam te laden 40 microliter van gel kralen naar rij twee. Doe 270 microliter van scheidingsolie af aan de putten van rij drie.
Haak de chippakking op de lipjes van de chiphouder. Plaats de gemonteerde chiphouder in het scheidingsapparaat met één cel en druk op de run-knop. Na afloop, verwijder de chippakking van de houder, open de chipkast onder een hoek van 45 graden en breng 100 microliters van de emulsie van de chip in een put in een blauwe plastic 65 putplaat.
Doe 125 microliter roze emulsie breken reagens in elke emulsie. Wacht een minuut en breng het volledige volume van elke put over in elke buis van 0,2 milliliter. Zorg ervoor dat er een laag van duidelijk en een laag roze in de buis strip.
Verwijder met een pipet 125 microliter van de roze laag van de onderkant van de buisstrip zonder de heldere laag te verstoren. Het is normaal dat een klein volume van ongeveer 15 microliter van de roze laag in de buis blijft. Voeg vervolgens 200 microliter van clean up mix toe aan elk van de buisstrips en broed gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
Breng de buisstrips over op een magnetische standaard en wacht twee minuten om de oplossing te kunnen verwijderen. Verwijder de supernatant en gooi het weg. Was vervolgens de kralen twee keer met 80%ethanol.
Laat de kralen een minuut drogen. Haal de buisstrips uit de magneet en voeg 35,5 microliter elutieoplossing toe aan de kralen. Pipette om de kralen opnieuw in de oplossing op te hangen en twee minuten bij kamertemperatuur uit te broeden.
Breng de buisstrips over op een magnetische standaard en laat de oplossing vrij. Breng het gezuiverde aanvullende DNA uit de buisstrips over om 0,2 milliliter buisstrips schoon te maken. Om het complementaire DNA te versterken, voeg je eerst 65 microliters van complementaire DNA-versterkingsmastermix toe aan elk monster.
Plaats de buis strips in een thermocycler en voer het programma volgens het manuscript. Monsters kunnen tot 72 uur bij vier graden Celsius worden bewaard. Na het normaliseren van het aanvullende DNA tot 15 anagrammen en 20 microliter, aliquot 30 microliter van tagmentatie mix aan elk complementair DNA monster op ijs.
Zet de monsters in de thermocycler en voer het tagmentatieprotocol vijf minuten op 55 graden Celsius, daalt tot 10 graden Celsius en houd het vast. Voeg vervolgens 60 microliter monsterindex PCR Master Mix en 10 microliter van 20-micromolar forolegol monster index toe aan het 30-microliter gezuiverde aanvullende DNA-monster. Breng de buizen terug naar de thermocycler om het uiteindelijke bibliotheekproduct te versterken.
Normaliseer elk monster met water tot twee nanogram per microliter en trek drie microliter van elk genormaliseerd monster samen in een buis van 1,5 milliliter. Verdun de pool met elutiebuffer tot 0,25 nanogram per microliter. Ontvolking van de pool door het combineren van 12 microliters van de verdunde pool monster, een microliter van een dier of DNA-controle, twee microliters van elutie buffer, en vijf microliters van 0,4 normale natriumhydroxide.
Incubeer het mengsel gedurende vijf minuten, voeg vervolgens 10 microliter van 200-millimolar Tris bij pH8, en laad 4,05 microliter van het mengsel in 1345,95 microliter van HTA-1. Laad vervolgens 1,3 milliliter in de cartridge van de sequencer en ren volgens de richtlijnen van de fabrikant met behulp van een sequencing recept. Voer op de computer Cell Ranger uit om raw-basisoproepbestanden te de-de-multiplex verwijderen die door sequencing in FASTQ-bestanden worden gegenereerd.
FastQ-bestanden afstemmen op menselijke b37.3 genoomassemblage en gebruik CSC-genmodel om expressiekwantificering te verkrijgen. Bestudeer de streepjescoderangplot om zeker te zijn van de scheiding van de aan de cel gekoppelde barcodes en de achtergrond. Om de celkwaliteit te controleren, sluit u cellen uit met minder dan 500 gedetecteerde genen, minder dan 3.000 in totaal aantal unieke moleculaire identificatiemiddelen en een score van meer dan 0,2.
Pas de cut-offs aan op basis van weefsel- en celtypen. Gebruik vervolgens R-pakket mclust om cellen te verwijderen die meer dan één hormoongen uitdrukken. Gebruik R-pakketseurat om genexpressie te normaliseren met de totale unieke moleculaire identificatiemiddelen en vermenigvuldig met een schaalfactor van 10.000 op celniveau.
Detecteer vervolgens variabele genen met behulp van de gemiddelde expressie en spreiding van alle cellen. Pas de cut-offs aan op basis van de weefsel- en celtypen. Voer de belangrijkste componentanalyse uit met de variabele genen.
Clustercellen met een geselecteerd aantal hoofdcomponenten. Afleiden cel cluster-verrijkte genen door het vergelijken van een cel cluster met de rest van de cellen. In dit 1cellige RNA-sequencingprotocol werden de verworven menselijke eilandjes eerst gescheiden zoals gevalideerd door de alfa- en bètacellen in RNA-fluorescentie en C2-hybridisatie.
Een succesvol voorbeeld van emulsie na de scheidingsstap toont een uniforme bleke, troebele oplossing met minimale scheidingsolie gescheiden van de gelkralen. In tegenstelling, een slechte kwaliteit emulsie met duidelijke fase scheiding tussen de gel kralen en olie kan te wijten zijn aan een klomp tijdens de chip run. Na aanvullende DNA-versterking, een representatieve fragment-sized distributie toont de typische piek voor een goede kwaliteit complementaire DNA-monster verbleven in de buurt van 1, 000 tot 2.000 basisparen.
De piek in de buurt van 600 basisparen was specifiek voor eilandje-complementair DNA. De fragment-sized distributie voor de RNA sequencing bibliotheken was tussen de 300 en 500 basisparen. De clustering analyse bleek 12 celtypen in de ruimte van T-gedistribueerde Stochastic Neighbor Embedding afmetingen.
Drie subpopulaties in alfacellen en vier in bètacellen werden onthuld. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om een uitgebreide cel eilandjes te bouwen voor menselijke eilandjes. Met meer gegevens van niet-diabetische en diabetische donoren, het wordt gebruikt voor bron voor therapeutische doelontdekking.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
