הכנה ושימוש בתאי השריר החלקים הרגילים של האדם הבודד לאפיון של 9-פניל-זרמים רגישים לקטיון

דטרוסור תאי שריר חלקים יוצרים את הקיר של שלפוחית השתן שבסופו של דבר מקל על ביטול השתן ואחסון. הפרוטוקול שלנו מספק שיטה מאומתת ואמינה לבידוד טרי של תאי שריר חלקים יחידים. תאי שריר חלקים מבודדים טריים מספקים הזדמנות לבדיקות אלקטרופיזיולוגיות ומולקולריות ברמת תא יחיד.

על ידי לימוד תאי שריר חלקים detrusor יחיד משליטה, נורמלי, ושלפוחיות השתן האנושיות חולה, יש לנו את ההזדמנות כדי לאמת מטרות פרמקולוגיות כגון תעלות יון. תאי שריר חלקים detrusor אנושי יחיד הם אידיאליים עבור ניסויים אלקטרופיזיולוגיים כגון אלקטרופיזיולוגיה מהדק טלאי. כאן נציג דוגמה של לימוד ערוץ יון יחיד בשם TRPM4, קולטן חולף פוטנציאל מלסטטין ארבעה ערוץ, שהוא ערוץ יון לא סלקטיבי.

טירונים עשויים להיאבק עם ניתוח וצעדי טיפול אנזימטי הדורשים יעילות והיכרות כולל הכרה בצעדים חשובים קריטיים להשגת תאי DSM מבודדים טריים. חשוב להכיר את היסטולוגיה של שלפוחית השתן האנושית, שלבי הפרוטוקול לבודד תאים בודדים נשארים גמישים, ובתחילה מצפים לקבל תאים תת-אופטימליים באמצעות פרוטוקול זה. התחל על ידי בחינת כל עובי דגימת שלפוחית השתן.

הצמד את הדגימה, רירית פונה כלפי מעלה serosa למטה על צלחת סיליקון מצופה 150 מ"מ עגול מלא DS קר כקרח בזהירות להסיר את כל רירית על ידי ניתוח חד. חותכים כמה חתיכות שרירים חלקים או DSM ללא רירית. מניחים שלוש עד שש חתיכות DSM לתוך צינור עם אחד עד שני מיליליטר של DS מחומם מראש המכיל פפאין dithiothreitol, או DS-P.

דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 עד 45 דקות, הקפד לנער את הצינור כל 10 עד 15 דקות. לאחר הדגירה, להסיר את DS-P מהצינור בקצרה לשטוף את חתיכות DSM עם קרח קר DS. להעביר את DS עם חתיכות DSM לצינור חדש ולהסיר את DS, משאיר את חתיכות DSM בתחתית הצינור. הוסף אחד עד שני מיליליטר של DS המכיל קולגן מסוג II, או DS-C, לצינור.

ולהודגר אותו ב37 מעלות צלזיוס עם רעידות מדי פעם. השליכו את ה-DS-C ושטפו את חתיכות ה-DSM שטופלו באנזים חמש עד עשר פעמים עם DS קר כקרח. לאחר הכביסה האחרונה להשאיר את DS בתוך הצינור, בעדינות triturate את החלקים עם פיפטה פסטר מלוטש אש לשחרר תאים DSM יחיד. פיפטה 0.25 כדי מיליליטר אחד של השעיית תא על תא תחתון זכוכית יושב על הבמה של מיקרוסקופ הפוך דגירה זה לפחות 45 דקות כדי לאפשר לתאים לדבוק.

לאחר מכן, להסיר את DS מהאמבטיה ולהחליף אותו עם פתרון E באמצעות עירוי על. משוך אלקטרודות טלאי מרובות, ללטש את קצות האלקטרודה, ולמעיל את הטיפים בשעווה דנטלית במידת הצורך. מלא את הקצה של אלקטרודה תיקון עם פתרון פיפטה ללא אמפיטריץ'ין-B על ידי טבילה קצרה של האלקטרודה בתסרון.

ההצלחה של אלקטרופיזיולוגיה של מהדק תלויה באיכות תא ה-DSM ובהתבודדות אמפיטריצין-B. מלאו את האלקטרודה באותה תספורת פיפטה המכילה אמפיטריצין-B והרו את האלקטרודה על מחזיק המחובר לשלב ראש מגבר מלחציים. השתמש micromanipulator למקם את האלקטרודה ממש מתחת לפני השטח של הפתרון החוץ תאי, כך קצה האלקטרודה הוא רק שקוע.

לאחר מכן, לקבוע את ההתנגדות אלקטרודה באמצעות פונקציית חלון בדיקת קרום של תוכנת הרכישה המסחרית ולקדם את האלקטרודה לכיוון התא של עניין. כאשר נוגעים בפני השטח של התא עם האלקטרודה, יוצרים חותם גיגה על ידי הפעלת לחץ שלילי מהיר ועדין על האלקטרודה באמצעות צינורות. התוצאה היא לחץ שלילי בקצה האלקטרודה וכתוצאה מכך ג'יגה-חותם מוצלח כפי שאושר על ידי בדיקת הממברנה.

אפשר 30 עד 60 דקות עבור amphotericin-B לפזר את פיפטה להיות מוכנס לתוך קרום הפלזמה, יצירת נקבוביות סלקטיבי בעיקר cations monovalent. המשך לעקוב אחר חותם הגיגה עם פונקציית בדיקת הממברנה. כאשר ניקוב התיקון הוא אופטימלי, לבטל את ארעי קיבוליות על ידי התאמת המחוגים עבור קיבוליות התא ועמידות הסדרה על המגבר.

לאחר שנצפו זרמי הקטיון היציבים של צעד המתח, הקליטו זרמים עם פרוטוקול צעד מתח הניתוב כמתואר בכתב היד. החל תרכובת או מצב בדיקה פיזיולוגית כדי לבדוק על ידי עירוי על ולתזמן את התגובות לתנאי הבקרה והבדיקה, כמו גם את הסחף. פרוטוקול זה יכול לשמש לבידוד תאי DSM בריאים ורעננים למחקרים פונקציונליים ומולקולריים.

תאי DSM בודדים בריאים מאופיינים על ידי מורפולוגיה בצורת ציר, קצוות פריכים ומוגדרים היטב, הילה מוגדרת היטב סביב התא ומראה התכווצות למחצה כאשר הם נצפים תחת המיקרוסקופ. יתר על כן, תאי ה- DSM המבודדים טריים מגיבים לגירוי מכני ולכרבכול. שברי תאים ותאים שאינם בני קיימא או מתעכלים יתר על כן יש להימנע בניסויים הבאים של מהדק טלאי.

התאים המבודדים שימשו בניסויי מהדק טלאי מחוררים אמפיטרצין-B שבהם נמדדו זרמים שלמים של תאים עם פרוטוקול צעד מתח המושרה או רמפה בשלושה תאי DSM אנושיים שונים. ניסויים גילו כי 9-phenanthrol, מעכב ערוץ TRPM4, ביעילות ובהידור מעכב זרמי חיתוך DSM אנושיים. רכיב הזרם הרגיש ל-9 פנינתול ממחיש עיכוב חזק יותר במתחים חיוביים ותיקון כלפי חוץ.

מצב של שלבי טיפול אנזימטיים, שלבים 2.2 ו 2.3, כולל טמפרטורה, משך טיפולים אנזימים, מקורות הרבה אנזימים ואיכות של תאי DSM, הם דטרמיננטים מרכזיים להשגת תאי DSM אנושיים באיכות גבוהה. תאי DSM אנושיים מתאימים באופן אידיאלי גם להערכת רמות השליח השני תאי כולל סידן ו- AMP מחזורי, גילוי ביטויי חלבון על ידי אימונוציטוכימיה, וביטוי שותף על ידי בדיקה משפטית פרוקסימלית situ, וביטוי mRNA על ידי RT-PCR, qRT-PCR, microarrays, ואת רצף הדור הבא. תאי DSM אנושיים קידמו את הבנתנו את התפקידים של ערוצי BK, סידן, TRPM4 בשלפוחית השתן.

התפתחויות עתידיות יאפשרו לקשר באופן ספציפי תכונות אלקטרופיזיולוגיות או פרמקולוגיות עם פרופילי התמלול או הפרוטום.