Här beskriver vi ett protokoll för att introducera en gen knockout i den extracellulära amastigote av Trypanosoma cruzi, med hjälp av CRISPR/Cas9 systemet. Tillväxten fenotyp kan följas upp antingen genom cellräkning av axenic amastigote kultur eller genom spridning av intracellulära amastigotes efter värd cell invasion.