Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Complexome-profilering med høj opløsning ved Cryoslicing BN-MS-analyse
Chapters
Summary October 15th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
En alsidig cryoslicing bn-MS protokol ved hjælp af en mikrotomen er præsenteret for høj opløsning complexome profilering.
Transcript
Det centrale mål for udviklingen af csBN-MS teknikken var at få omfattende adgang til organisering og samling af proteinkomplekser, der ligger til grund for signaltransduktion på og på tværs af plasmamembranen af forskellige typer af væv og organer. csBN-MS giver i øjeblikket den højeste opløsning alsidighed til analyse af indfødte protein kompleks og deres underenhed sammensætning, især med hensyn til membran proteiner. Selv om csBN-MS-teknikken blev udviklet til at analysere komplekse blandinger af membranproteinsamlinger i gnaverhjernen, kan den nemt tilpasses til analysen af enhver form for biologisk prøve.
Et af de vigtigste trin i vores metode er indlejring af gelstykket og dets korrekte tilpasning til beskæringsplanet, før det skæres. Pas på ikke at rive eller komprimere gelen og sørg for, at den ikke vippes til beskæringsplanet, da dette ville reducere analysens opløsning. Vores csBN-MS teknik har flere praktiske trin, der er afgørende for gode resultater.
Det er nemmere at vise, hvordan du udfører disse trin i detaljer end ved blot at beskrive dem. For at begynde denne procedure bruge en omrøring to-kammer gradient mixer drevet af en pumpe til at kaste en lineær eller en hyperbolsk pore gradient gel. Forbered løsninger til det forreste blandingskammer og reservoirkammer som beskrevet i tekstprotokollen.
Start omrøreren og tilsæt 30 mikroliter APS og 2,5 mikroliter TEMED til opløsningen i frontkammeret. Start derefter pumpen og åbn den forreste ventil. Efter ca. et minut tilsættes 90 mikroliter APS og fem mikroliter TEMED til reservoirkammeret og åbnes kammerforbindelsen.
Lad gelen polymerisere langsomt og grundigt i mindst 24 timer ved stuetemperatur for at generere en homogen pore størrelse gradient. Hvis den holdes fugtig, kan den polymeriserede gel opbevares oprejst ved fire grader Celsius i op til en uge. Derefter forberedes læssepladserne ved at indsætte de relevante mellemrum mellem glaspladerne til adskillelse mellem 0,5 og 2,0 milligram protein.
Slots skal være mindst tre centimeter brede. For løbepuder skal du forberede en stående katodebuffer bestående af 50 millimolartrine, 50 millimolar Bis-Tris og 0,01%Coomassie G-250. Forbered en standard anode buffer bestående af 50 millimolar Bis-Tris.
Opløses ca. 2,5 milligram membran og to milliliter opløselsesbuffer indeholdende 1% ikke-denatureringsmiddel på is i 30 minutter. Derefter ultracentrifuge på 130, 000 gange G i 11 minutter. Solubilisatet koncentreres på en kort 50%20%saccharose trin gradient ved ultracentrifugering ved 400, 000 gange G i en time.
Efter dette, høst saccharose gradient fra bunden af røret, tilsæt 0,05%Coomassie G-250 til solubilisate, og læg prøven på gelen. Kør en præparativ BN-PAGE ved 10 grader Celsius natten over ved hjælp af en tre-trins spænding protokol, som skitseret i tekstprotokollen. Når gelen har kørt, skal gelerne scannes med henblik på dokumentation, samtidig med at den opbevares mellem glaspladerne.
Undersøg kvaliteten af geladskillelsen. Dernæst dissemble pladerne og punktafgifter lane dele af interesse. Fastgør banerne to gange med 30% ethanol og 15% eddikesyre i mindst 30 minutter.
Prøven af indlejringsmediet overføres, og den sættes i blød og skal være ligevægt i mindst to timer, mens gelpladen opbevares i slowmotion på en orbitalshaker. Skær derefter de faste gelbaner i sektioner nøjagtigt parallelt med proteinmigrationsfronten eller båndmønsteret. Placer hvert afsnit på en plastfilm støtte med lige dimensioner for lettere håndtering.
Overfør banerne til et åbent rør med propper, der er lukket i bunden og centralt perforeret på toppen, både præcist på linje med den øvre og nedre ende af gelsektionen. Dyp cylinderen i væskens nitrogen kortvarigt for hurtigt at starte størkningen. Det gennemsigtige indlejringsmedie størkner inden for få sekunder og bliver hvid i farven.
Fyld hulrummet med indlejring medium, kort dyppe cylinderen i flydende nitrogen, og lad det fryse grundigt ved minus 20 grader Celsius i flere timer. Efter demontering fjernes plastfilmen, og blokken overføres med den indlejrede gelsektion til en afkølet metalcylinder. Cylinderen er større i diameter og forseglet på ydersiden med indlejringsmedium.
Det er placeret på en flad støtte. Fyld cylinderen med indlejringsmedium og frys grundigt som nævnt før. Gentag denne procedure med den anden side af cylinderen for at opnå en fast blok med en coplanar bundoverflade.
Fjern derefter blokken fra cylinderen og brug indlejringsmediet til at lime den til en forkølet metalholder. Sæt metalholderen i kryoslicingsmaskinen. Holderen skal være nøje afstemt i forhold til udskæringsplanet.
Lad blokken kvæde til den optimale temperatur for udskæringsprocessen. Efter denne høst gel skiver den ene efter den anden med en endelig ønskede tykkelse på 0,25 millimeter trin størrelse og overføre dem individuelt til reaktion rør med lavt protein bindende egenskaber. Derefter udsættes skiverne for tryptisk fordøje og massespektrometrisk analyse.
Denne protokol udvider anvendelsen af høj opløsning complexome profilering til ikke-mitokondrielle membraner udtrykke lav-rigelige proteiner. Kompleks adskillelse viser stærkt farvede proteinbånd med meget lidt migrationsartefakter. Afvigelser fra peptidsignaler i masse- og retentionstid indikerer en meget lav hastighed for falsk positiv spidsvolumentildeling.
Variationer, der køres for at køre, elimineres nemt ved at genberegne datasættene for spidsbelastningsvolumen. Den resulterende peptid intensitet oplysninger bruges derefter til at rekonstruere 2545 protein profiler af relativ overflod. Relevansen af gelprøvetagningstrinstørrelse for opløsningen af proteinkomplekser blev vurderet ved sammenføjning af datasæt af tilstødende skiver.
På 0,25 millimeter, størrelse adskillelse af TPC1 associerede komplekse populationer er pænt i overensstemmelse med resultaterne fra vestlige blot analyse. Sammenføjning af mere end to skiver afskaffer forskelsbehandling af TPC1 komplekse delpopulationer. Endelig giver analysen oplysninger om vel karakteriserede komplekser og viser eksistensen af nye underenheder og komplekse forsamlinger.
For ferritin tyder underenhedens profiler justeret for deres relative forekomst på, at der findes mindst tre komplekse isoformer med tydelige tunge/lette kædesmøtomeposter. I modsætning hertil viser nicalin-nomo1 komplekser, gamma-sekretase kerne kompleks, og GPI-transamidase maskiner har faste overflodsforhold af deres kerne underenheder over hele størrelsesområdet og uafhængig af forening med yderligere proteiner. Det vigtigste parameter i csBN-MS-analysen er den effektive løsning af komplekser, som bestemmes af prøvebiokemi, BN-gelkvalitet, korrekt justering under indlejring og udskæring og kvaliteten af de erhvervede MS-data.
Kæmning csBN-MS med isotop mærkning af proteiner og prøver vil give mulighed for direkte sammenligning af komplekse stoffer på forskellige patofysiologiske, biologiske eller udviklingsmæssige tilstande. csBN-MS udført på membraner fra gnaver hjernen afslørede den enorme mangfoldighed af receptorer, ion kanaler, og transportører med hensyn til deres underenhed sammensætning og deres funktion, og det vil være medvirkende til at analysere 3D-struktur i indfødte præparater.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.