Bildebehandling og analyse av vevsorientering og vekstdynamikk i developing Drosophila Epithelia under pupal stadier

Innenfor flercellede organismer viser vev høye grader videre i sin romlige orientering. Celler justere og vise en rekke prioritet over store avstander i løpet av morfogenese. For å forstå hvordan epitelens planære ordninger nås under utviklingen, er det avgjørende å spore cellens orienteringer og vekstdynamikk med høy spacial temporal troskap in vivo.

Den beskrevne protokollen er utformet for å bilde og analysere celleatferd på globalt og lokalt nivå i drosophila pupal epidermis. Denne metodikken kan gi innsikt i ulike teorier om forskning, cellebiologi, morfogenese og planar polaritet og kan brukes til analyse av andre vev, strukturer og modeller. Alle trinnene kan utføres enkelt etter litt øvelse.

De krever presisjon. Visualisering av denne protokollen bidrar til å oppnå optimale resultater på kortere tid. Pupal disseksjon er kompleks.

Til å begynne med, bruk en fuktet pensel til å overføre iscenesatt hvit pre-pupae til et friskt plast hetteglass, og hold dem der så lenge som nødvendig ved 25 grader Celsius. Fjern deretter hver pupper fra hetteglassets vegg ved hjelp av tang. Lim ventral side av hver pupa på et glass lysbilde dekket med dobbeltsidig klebrig tape.

Trykk forsiktig på hodespirakler og den dorsale overflaten av puppen med spissene på tangene for å sikre vedheft av pupalsaken til båndet. Begynn disseksjon under et stereomikroskop ved å forsiktig fjerne operkulumet fra puparium med tangene. Sett inn en spiss av tangen i et grunt mellom puppetuiet og puppetoverflaten gjennom den operkulære åpningen.

Riv saken fra hode til hale sidealt i en eller flere svinger, unngå å klemme puppen. Brett tilbake den sprukne pupalsaken til sidesidene mens du fortsetter til den bakre enden. Fjern puppen fra det åpnede pupal tilfellet ved å sette tangen forsiktig under dyret og forsiktig trekke opp.

Puppen holder seg til spissen av tangen. Hold puppen forsiktig ved ventral side, og overfør puppen til en glassbunnet tallerken på toppen av en liten dråpe gassgjennomtrengelig halokarbonolje. Rull et stykke vått vev papir på kantene av parabolen og dekke parabolen for å opprettholde fuktighet.

Orienter puppen over oljedråpen på glassbunnede retter i henhold til domenet og prosessen som skal evalueres. For langsiktig levende avbildning av den tidlige utvidelsen av dorsale reir, orienterer dorsal lateralt puppene. For å se for seg deres sene ekspansjon og vevs ombygging, orienterer du dorsally puppen.

Overfør glassbunnet tallerken som inneholder den monterte puppen til mikroskopstadiet og fokuser på overflaten av bukområdet ved hjelp av overført lys. For å bruke mitotisk rekombinasjon for å indusere genetiske mosaikker i bukeepitelet, forberede jomfrukvinner som bærer et varmesjokk induserbar flipase, et FRT-sted på et bestemt genomisk sted, og en gjenkjennelig cellulær markør distal til FRT-stedet. Forbered muterte menn som bærer et FRT-sted på tilsvarende genomisk sted.

Kryss flere kvinner og menn i en tre til en andel i et plast hetteglass ved 25 grader Celsius i fire til fem dager. For å generere somatiske kloner i histoblastene, utfør varmesjokkbehandling på det tredje instar larvalstadiet av korsets avkom ved å senke plastkuleglassene som inneholder dyrene i et vannbad ved 37 grader Celsius i 45 minutter til en time. I bildet J-programvaren bruker du funksjonen for maksimal intensitetsprojeksjon til å beskytte Z-stakkskiver anskaffet av konfokal mikroskopi i 2D.

Reiret har en karakteristisk form som orienterer dem i et planar koordinatsystem fremre til venstre og dorsal til toppen. For å oppnå optimale resultater med denne analysen må inndatabildet kjøpes med høy oppløsning. Hvis du vil hente kvalitative orienteringsverdier på lokale cellekanter, klikker du på plug-in-menyen og velger alternativet retning J-distribusjon.

Sett gaussisk vindu sigma til en piksel, kubikk spline til gradient, minimum sammenheng til 20 prosent, og minimum energi til en prosent. Bruk fargeundersøkelsesalternativet for plugin-modulen. Sett fargetone til retning, metning til sammenheng og lysstyrke for å skrive inn bilde.

Denne fargekoder cellekantretningen i forhold til det angitte planarkoordinatsystemet. Deretter bruker du alternativet retning J-mål under plug-in-menyen til å kvantifisere mobilretninger og retningsbestemt celle til cellejustering. Generer små, tilstøtende ikke-overlappende områder av interesse for ensartet vekt rundt 20 mikrometer ganger 20 mikrometer i området okkupert av histoblastene.

Hvis du trykker på mål, beregnes den dominerende lokale retningen og sammenhengen fra ROIene. I denne studien er metodikken som brukes, i stand til å generere høyoppløselige filmer av den utviklende puppen i perioder på opptil 48 timer uten betydelig fotobleking eller fototoksisitet. Eksempler på villtypekloner preget av fravær av RFP NLS og deres tvillingflekker 26 timer etter pupariumdannelse er vist her.

Klonene langstrakte langs segmentgrensene. Tvillingkloner arrangert parallelt eller i tandem. Morfologi av en vill type klone på 26 timer og 47 timer etter puparium dannelse viser komplekse grensen morfologi i begge stadier.

Boks- og whisker-plott for geometriske parametere ved 26 timer og 47 timer etter pupariumdannelse viser at det gjennomsnittlige området og omkretsen økte betydelig i dette tidsvinduet. Klone orientering ble opprettholdt under ekspansjon og ombygging. Formparametere ved 26 timer og 47 timer etter pupariumdannelse indikerer grovhet, rundhet og sirkularitet knapt endret seg i de ville klonene.

Pass på å ikke skade puppen, ellers vil den dø innen få timer, noe som påvirker levende bildebehandling. Denne protokollen krever ikke at en sartus reagens eller instrument brukes. Unngå å klemme deg selv når du dissekerer.

Ved å bruke disse metodene mulig å generere høyoppløselige filmer i lange perioder ved hjelp av ulike forestille teknikker. Fokal til foton eller spinnende disker. Kloranalyse kan brukes til å utforske ikke-autonome reaksjoner siden tilfeldige celler letter i identifisering av krysssamtaler eller cellekommunikasjonsmekanismer.

Disse metodene kan enkelt tilpasses for å studere et komplett spekter av morfogenetiske fenomener, inkludert koordinering av epidermal, muskuløs og nevroutvikling under metamorfose.