Imaging och analys av vävnadsorientering och tillväxtdynamik i utvecklande Drosophila Epithelia under pupal stadier

Inom flercelliga organismer visar vävnad höga grader ytterligare i sin rumsliga orientering. Celler anpassa och visa en rad prioritet över stora avstånd under loppet av morfogenes. För att förstå hur planararrangemangen av Epithelia nås under utvecklingen är det avgörande att spåra cellens inriktningar och tillväxtdynamik med hög spacial temporal trohet in vivo.

Det beskrivna protokollet är utformat för att avbilda och analysera cellbeteenden på global och lokal nivå i drosophila-pupal epidermis. Denna metodik kan ge insikter i olika forskningsteori, cellbiologi, morfogen, och planar polaritet och kan tillämpas på analys av andra vävnader, strukturer och modeller. Alla steg kan utföras enkelt efter lite övning.

De kräver precision. Visualisering av detta protokoll hjälper till att uppnå optimala resultat på kortare tid. Den pupal dissekering är komplex.

Till att börja med använder du en fuktad pensel för att överföra iscensatta vita pre-puppor till en färsk plastflaska, och hålla dem där så länge som behövs vid 25 grader Celsius. Ta sedan bort varje puppar från väggen i injektionsflaskan med hjälp av tuppar. Limma den ventrala sidan av varje pupa på en glasrutschbana täckt med dubbelsidig tejp.

Knacka försiktigt på huvudet spiracles och den dorsala ytan av puppan med spetsarna på tärna för att försäkra vidhäftningen av pupal fallet till bandet. Påbörja dissektion under ett stereomikroskop genom att försiktigt ta bort operculumet från pupariumet med tärnorna. Sätt in en spets på tärnarna i en grund mellan pupal-fodralet och poppytan genom operkuläröppningen.

Riv fallet från huvud till svans i laterled i en eller flera gungor, undvika nypa puppan. Vik tillbaka den knäckt pupal fall till den laterala sidor som du fortsätter att fortsätta till den bakre änden. Ta bort poppen från det öppnade pupalfallet genom att försiktigt föra in trikrån under djuret och försiktigt dra upp.

Puppan fastnar på spets på tniparna. Håll poppan försiktigt vid den ventrala sidan och överför poppan till en glasbottnad skål ovanpå en liten droppe gaspermeabel halocarbonolja. Rulla en bit vått mjukpapper i kanterna på skålen och täck skålen för att upprätthålla luftfuktigheten.

Orient puppan över oljedroppen på glasbottnad rätter enligt domänen och den process som skall utvärderas. För långsiktig levande avbildning av den tidiga expansionen av dorsala bon, dorsala i laterled orientera puppan. För att avbilda deras sena expansion och vävnadsremodellering orienterar dorsally puppan.

Överför glasbottnad maträtt som innehåller den monterade puppor till mikroskopstadiet och fokusera på bukområdets yta med hjälp av överfört ljus. Att anställa mitotiska rekombination att inducera genetiska mosaiker i buken epitel, förbereda jungfruliga honor som bär en värme chock inducerbara flipas, en FRT plats på en specifik genomisk plats, och en igenkännlig cellulära markör distala till FRT webbplats. Förbered mutanthanar som bär på en FRT-plats på motsvarande genomiska plats.

Korsa flera honor och hanar i en tre till en andel i en plastflaska vid 25 grader Celsius i fyra till fem dagar. För att generera somatiska kloner i histoblasterna, utför värmechockbehandling vid det tredje instar larval-stadiet av korsets avkomma genom att dränka plastflaskorna som innehåller djuren i ett vattenbad i 37 grader Celsius i 45 minuter till en timme. I programvaran image J, använd maximal intensitet projektionsfunktion för att skydda Z stack skivor som förvärvats av confocal mikroskopi i 2D.

Bonen har en karakteristisk form som orienterar dem i ett planar koordinatsystem anterior till vänster och ryggtill toppen. För att uppnå optimala resultat med denna analys måste indatabilden förvärvas med hög upplösning. För att erhålla kvalitativa orienteringsvärden på lokala cellkanter, klicka på plug-in-menyn och välj alternativet orientering J fördelning.

Ställ gaussiska fönstret sigma till en pixel, kubik spline till toning, minsta coherency till 20 procent, och minsta energi till en procent. Använd färgundersökningsalternativet för plugin-programmet. Ange nyans till orientering, mättnad till coherency och ljusstyrka för att mata in bild.

Den här färgen kodar cellkantorienteringar i förhållande till det inställda planarkoordinatsystemet. Därefter, under plug-in-menyn, använd alternativet orientering J mått för att kvantifiera cellulära orienteringar och riktningscell till celljustering. Generera små, angränsande icke-överlappande regioner av intresse av enhetlig vikt runt 20 mikrometer gånger 20 mikrometer inom det område som upptas av histoblasterna.

Genom att trycka på mått beräknas den dominerande lokala orienteringen och coherency från ROIs. I denna studie, den metod som används kan generera högupplösta filmer av utvecklande puppor för perioder på upp till 48 timmar utan betydande foto blekning eller foto toxicitet. Exempel på vilda typkloner som markeras av frånvaron av RFP NLS och deras tvillingfläckar vid 26 timmar efter pupariumbildningen visas här.

Klonerna långsträckta längs segmenternas gränser. Tvillingkloner arrangerade parallellt eller i tandem. Morfologi av en vild typ klon på 26 timmar och 47 timmar efter puparium bildas visar komplexa gränsen morfologi i båda stadierna.

Box och morrhår tomter för geometriska parametrar vid 26 timmar och 47 timmar efter puparium bildas visar den genomsnittliga området och omkretsen ökat betydligt i denna tid fönster. Klonens orientering var ihållande under expansion och ombyggnad. Formparametrar vid 26 timmar och 47 timmar efter pupariumbildningen indikerar ojämnhet, rundhet och cirkulärhet som knappt ändrats i vildtypklonsarna.

Var noga med att inte skada puppan, annars kommer det att dö inom några timmar, vilket påverkar levande bildbehandling. Detta protokoll kräver inte att ett sartusreagens eller -instrument används. Undvik att nypa dig själv när du dissekerar.

Genom att tillämpa dessa metoder möjligt att generera högupplösta filmer för lång sikt perioder med hjälp av olika föreställa tekniker. Fokal till foton eller snurrande diskar. Kloralanalys kan användas för att utforska icke-autonoma svar eftersom slumpmässiga celler underlättar vid identifiering av korssamtal eller cellkommunikationsmekanismer.

Dessa metoder kan lätt anpassas för att studera ett komplett utbud av morfogogenetiska fenomen, inklusive samordning av epidermal, muskulös, och neuro utveckling under metamorfos.