Time-lapse Live Imaging och kvantifiering av snabba dendritiska grenen dynamik i utvecklingen Drosophila nervceller

Detta protokoll ger en ny metod för att kvantifiera gren dynamik dendritiska berså och utveckla nervceller med hjälp av levande tid förfaller imaging och en 3D-bild anteckning programvara. Denna teknik bilder och spår grenen terminaler ger en snabb och effektiv metod för att mäta de dynamiska beteenden dendritiska filopodia. Forskning med denna metod ger insikt i att förstå hur utveckling och aktivitet reglerar dendrit morfogenes.

Våra metoder är tillämpliga på glest märkta nervceller i både in vitro- och in vivo-inställningar. När du utför denna procedur, kom ihåg att de bildframställning parametrarna måste justeras noggrant för att uppnå en tillräcklig tidsmässiga och rumsliga upplösning. För att skörda hjärnor från larv drosophila, under en dissekera mikroskop använda ett par nummer fem standard spets dissekeringsånger för att hålla en larvprov på plats medan du använder den andra för att noggrant dissekera ut hjärnan, bevara ögat diskar, hjärnlober, och ventral nerv sladd.

Ta sedan bort de bifogade musklerna för att minimera eventuella rörelser av provet under bildtagning. När alla hjärnor har skördats, använd vakuumfett för att dra en fyrkantig kammare på en glasrutschkana och tillsätt 20 mikroliter yttre saltlösning till kammaren. Använd triktorna för att överföra hjärnorna till kammaren och justera hjärnornas positioner under mikroskopet med ryggsidorna uppåt.

Täck kammaren med en glaskåpa slip och tryck försiktigt på luckan för att minska provdrivor under bildtagningsproceduren. För att identifiera hjärnan explants som innehåller individuellt märkta nervceller, inom 30 minuter efter dissekering välj en 40X vatten nedsänkning mål och en epifluorescens ljuskälla. Välj en två fotonlaser inställd på 920 nanometer och en icke Dscan-detektor och ställ in bildbehandlingsparametrarna för att samla in bilderna på 512 med 512 pixlar per bildruta och en minut per Z-stack i 10 minuter.

Justera sedan den optiska och digitala zoomen för att uppnå en tillräcklig X- Y-, Z-upplösning samtidigt som du säkerställer täckningen av hela dendritiska bersåen inom en minut. Inställningarna kommer att generera bilder med en typisk X, Y, Z upplösning på 0,11 med 0,11 x 0,25 mikrometer. För avdrift korrigering, öppna filen av intresse i en lämplig driftkorrigering program och klicka på Redigera och Redigera mikroskopiska parametrar.

Ställ in mikroskoptypen till Wide Field för de två fotonbilderna om det finns ett alternativ för två fotoner och följ arbetsflödet som definierats av programvaran. För avvikelse, öppna drift korrigerad bild i deconvolution programvara och följ arbetsflödet. Spara sedan den deconvolved bilden i en filtyp som stöds av den efterföljande bildanteckningsprogramvaran som kan analysera 4D-data och rapportera de rumsliga koordinaterna för definierade fläckar inom bilden.

För bildanteckning öppnar du den deconvolved bilden i programvaran bildanteckning och undersöka och markera gren tips hela tiden punkter i 3D. Bildanteckningsprogramvaran kommer att rapportera och lagra de rumsliga och tidsmässiga koordinaterna för de markerade grentipsen. Exportera koordinatinformationen som en CSV-fil för efterföljande beräkningar.

Klicka på Hoppa över automatiskt skapande i modulen Fläckar, Redigera manuellt och markera kryssrutan Koppla automatiskt till markerad dekor. Granska bildrutorna i tidsserien och välj en gren för anteckning. Håller Skift-tangenten, klicka på grenen terminal tips för att lägga till en plats.

Klicka sedan på fliken Statistik, välj Detaljerade, Specifika värden och Placering. Den inspelade rumsliga och tidsmässiga koordinatinformationen kommer att visas. Klicka på Spara om du vill exportera informationen som en CSV-fil.

Om du vill beräkna grenspetsplaceringen i 3D öppnar du CSV-filen som ett kalkylblad och väljer kolumnen Spåra ID. Klicka på Sortera minst till störst och acceptera Expandera markeringen. Efter sorteringen kommer Track ID att identifiera varje unik dendritgren och fläckarna från samma gren delar samma Track ID.The Time-kolumnen kommer att lagra informationen från olika tidsramar.

I kalkylarket lägger du till en Distance-kolumn och använder koordinaterna för att beräkna avståndet för varannan temporalt intilliggande fläckar. För att mäta mindre rörelser på nivån med enkel voxel återställer du alla avståndsvärden som är mindre än 0,3 mikrometer för att filtrera eventuell okorrigerad drivande eller ofullkomlig bildanteckning. Därefter skapar du en Förskjutningskolumn och kopierar värdena från kolumnen Avstånd till kolumnen Förskjutning.

Tilldela förlängnings- och tillbakadragningshändelser manuellt för varje grenspets. Om det är en förlängning, lämna det positiva förskjutningsvärdet oförändrat. Om det är en upprullning, ändra motsvarande förskjutningsvärde till ett negativt värde.

Sedan, i en ny Händelse kolumn, summera de förskjutningsvärden för enskilda förlängning och indragning händelser. I denna video, en maximal intensitet projicerade bildserie samlas in från en representant individuellt märkt ventrala laterala neuron kan observeras. Med enstaka bildruta kan du utvärdera om de infällbara och extensionshändelserna.

Halvautomaterade 4D-spårning av filialterminalerna möjliggör annotering av de dynamiska gren terminalerna för individuellt märkta ventrala laterala nervceller som visat. Beräkning av riktningen och avståndet för grenen rörelser vid varje tidpunkt kan en jämförelse av dendritiska grenen dynamik för individuellt märkta ventrala laterala nervceller på olika utvecklingsstadier. Det viktigaste steget är att bevara integriteten hos hjärnvävnaden och dendritmorfosoloy under dissekering och montering.

Den råa bildserie kvalitet är också avgörande för framgångsrik spårning och kvantifiering. Med hjälp av denna teknik fick vi förmågan att utföra kvantitativ analys av dendrite filopodia i utvecklingen av drosophila centrala nervceller och att utforska de molekylära maskiner som rör dendrit mognad och synaptogenesis.