Immunology and Infection
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Analyse af gruppe IV-virale SSHHP'ER ved anvendelse af in vitro-og silico-metoder
Chapters
Summary December 21st, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi præsenterer en generel protokol til at identificere korte strækninger af homologe Host-patogen protein sekvenser (SSHHPS) indlejret i viral polyprotein. SSHHPS er anerkendt af virale proteaser og direkte den målrettede ødelæggelse af specifikke Host proteiner af flere gruppe IV vira.
Transcript
Vi har vist, at gruppe IV virale genomer indkode korte strækninger af vært protein sekvenser. Disse sekvenser kan findes inden for den virale protease spaltning steder. De bliver brugt til målrettet ødelæggelse af værtsproteiner, typisk proteiner involveret i at generere immunrespons.
En stor fordel ved at bruge protease assays er, at det fjerner kompleksiteten af en celle og viser, hvorvidt en viral protease kan kløve en bestemt sekvens. Så da vi analyserede Zika SSHHPS sekvenser, fandt vi, at protease kunne skære sekvenser i proteiner, der er involveret i at generere immunrespons, og at nogle af disse proteiner også havde roller i hjernen og øjet udvikling. Når du udfører denne teknik for første gang, skal man huske, at hvis spaltning ikke overholdes, at det kan skyldes en række faktorer, såsom aktiviteten af protease.
Demonstrationen af proceduren vil være Jaimee Compton, en tekniker fra mit laboratorium. Start med at åbne Protein BLAST og sætte de 20 aminosyrer omkring scissile binding og viralpolyprotein og vælg ikke-overflødige proteinsekvenser og skriv derefter i værtsgenomet, der skal søges. Hvis det er nødvendigt, skal du vælge PHI-BLAST og skrive i en mønstersekvens, hvor kantede parenteser angiver, at enten aminosyren i beslagene kan være på erstatningspositionen, og tryk derefter på BLAST.
Rang for BLAST-hitsene baseret på antallet af på hinanden følgende identiske eller tolererede rester, der matcher en spaltningssekvens. På listen udvælges de proteiner, der indeholder seks eller flere identiske eller lignende restkoncentrationer til analyse i proteaseanalyserne. Konstruere en plasmid kodning cyan fluorescerende protein, op til 25 aminosyrer i spaltning sekvens, og den gule fluorescerende protein.
Dernæst forberede den fælles fiskeripolitik og YFP substrater ved at vaccinere fire fire liters kolber med 25 milliliter af en overnight kultur. Ryst kulturerne ved 37 grader Celsius og overvåge væksten hver time ved UV-Vis spektroskopi ved 600 nanometer. Når bakterierne når en absorbans på omkring en, fremkalde protein udtryk ved at tilføje 0,5 milliliter af en molar IPTG til hver kolbe, derefter sænke temperaturen af rystende inkubator til 17 grader Celsius og lad udtrykket fortsætte natten over i 17 til 20 timer.
På den næste dag, pellet bakterierne ved centrifugering ved 7000 gange g i 10 minutter ved 4 grader Celsius. Fjern og kassér de flydende medier derefter gemme pellets på minus 80 grader Celsius eller fortsætte med celle lysis. For at lyse cellerne skal der forberedes 100 milliliter lysisbuffer i henhold til manuskriptretninger, opslænge pellets i bufferen og overføres 25 til 25 milliliter af suspensionen til 50 milliliter engangskonicalrør.
Læg rørene i et plastikbæger med isvand, og sæt derefter sonikatorspidsen ind i røret, så spidsen er omkring en centimeter fra bunden af røret og sonikerer lysatet 10 til 20 gange, indtil det bliver flydende og flydende. Efter sonikering overføres lysatet til centrifugerør med høj hastighed og centrifugeres ved 20, 500 x g i 30 minutter ved 4 grader Celsius. Overfør supernatanten til en ren flaske og kassér pillerne.
Lysatet indlæses på nikkelkolonnen, og vask derefter kolonnen med to kolonnemængder af buffer A efterfulgt af fem kolonnemængder på 20%buffer B.Absorbans ved 280 nanometer øges under vasken, da forurenende stoffer fremkaldes fra kolonnen. Fortsæt med at vaske, indtil A280 vender tilbage til basisværdier. Derefter eluterer proteinet med to til tre kolonnevolumener på 100%buffer B og opsaml 10 milliliterfraktioner, og sørg for at måle A280 for hver fraktion.
Forbered otte reaktioner blander i henhold til manuskript retninger og pipette 45 mikroliter af hver blanding i de første tre brønde i hver række af en sort halv-område 96-godt plade. Opsæt pladelæseren til samtidig detektering af lysstofrør ved to bølgelængder med fast indstilling af fotomultiplierrør. Program læsetid til 20 til 30 minutter med en læse per minut og vælge de brønde, der skal læses.
Sæt pladen i maskinen og start aflæs, overvågning af emissionsforholdet over tid. Der skal afsendes et slutpunkt af pladen med det uskåret underlag. Fjern pladen og pipetter fem mikroliter af enzym i hver brønd.
Man kan gemme den første kolonne som et uklippet kontrolelement. Læs derefter pladen igen i 20 til 30 minutter, og sørg for at indstille pladelæseren til output absolutte værdier. Når afningen er færdig, forsegles pladen med film for at forhindre fordampning og lade den overnatte ved stuetemperatur, så enzymet kan skære underlaget helt.
Efter 24 timer skal du fjerne filmen og udføre en slutpunktslæsning af pladen. Gennemsnitlige emissionsforhold og registrere dem som snit. Bekræft substratets spaltning ved hjælp af SDS-PAGE.
Læg en molekylvægtmarkør i den første eller sidste vognbane, og indlæs fem mikroliter af hver reaktionsblanding i en vognbane af gelen, begyndende med den uslebne reaktion. Fastgør geltankens elektroder til strømforsyningen og kør produkterne ved 110 volt i 60 minutter. Fjern gelen fra kassetten ved hjælp af et sprækker værktøj og nedsænkes i fem til 10 milliliter farvning løsning.
Efter en til 24 timer, fjerne den overskydende plet og nedsænkes gelen i vand. Tag derefter et billede af gelen ved hjælp af en gel imager. For at forberede proteinstrukturen skal proteinets PDB-fil indlæses i MOE.
Klik på Vælg og Opløsningsmiddel, og slet derefter opløsningsmidlet. Åbn panelet Struktur pPreparation fra menulinjen Beregn øverste, og ret automatisk alle strukturelle elementer ved at klikke på Ret. Protonate strukturen ved at klikke protonat 3D.
Tilføj delvise gebyrer til proteinet ved at åbne panelet Delvise gebyrer og vælge AMBER 99 og Juster brinter og enlige par efter behov. Gem derefter strukturfilen. Hvis du vil opbygge strukturen for substrate peptider og TRIM14, skal du åbne panelet Protein Builder, indtaste underlagets sekvens og vælge Auto ompakning.
Derefter skal du indstille Geometri som Udvidet og klikke på Byg. Endelig minimere strukturen og gemme det som en PDB fil. Dock substrate peptider til VEEV-nsP2 ved hjælp af PyRx AudoDock 4.2 software.
Indlæs proteinet, højreklik på navnet, og vælg Gør makromolekyle for at forberede dockingfilen PDBQT. Indlæs derefter substratmolekylet, og vælg Make Ligand for at forberede liganddockingfilen. Start guiden Autodock på dockingpanelet nederst, og vælg de forberedte ligand- og proteinfiler.
Definer den proteinbindende lomme ved manuelt at justere gitterdimensionen og derefter køre AuotGrid. Kør derefter AutoDock, og vælg den Lamarckian genetiske algoritmemetode. Klik på Docking Parametre og indstille antallet af GA kører til 50 og klik derefter på Fremad for at starte docking køre.
Når AutoDock er fuldført, skal du åbne panelet Analysér resultater og undersøge alle forudsagte bindingsstillinger. Vælg den bedste model med den laveste forudsagte bindende energi og rimelige bindende interaktioner mellem cis-477 og substrat på spaltningsstedet, og gem den derefter som en PDB-fil til yderligere MD-simuleringer. Efter at have læst bindingen udgør med AutoDock, er det vigtigt at udføre post-docking analyse for at identificere den plausible bindende model for raffinement med MD simuleringer.
Denne protokol blev brugt til at finde korte strækninger af homologe vært-patogen protein sekvenser eller SSHHPS i Zika virus ns2B/3 protease. Der blev identificeret fire værtsproteinmål. FOXGS, SFRP1, en Gsalpha underenhed fra et retinalt cDNA bibliotek, og NT5M mitokondrielle 5'3'nukleotidase.
Sekvensjusteringer af SSHHPS tillod artsspecifikke forskelle i spaltningsstedets sekvenser. SFRP1-sekvensen var identisk hos mennesker og kyllinger, hvilket er bemærkelsesværdigt, fordi Zika-virus kan fremkalde dødelighed og microcephaly i kyllingembryoner. Den kontinuerlige analyse blev anvendt til at måle steady state kinetiske parametre og hæmning konstanter for viralpolyprotein sekvenser og diskontinuerlig analyse blev brugt til at opnå kvalitative spaltning oplysninger, såsom spaltning af en bestemt sekvens eller hæmning af protease af forskellige forbindelser.
En model af den venezuelanske heste encephalitis nsP1-nsP2 krydset blev foretaget ved hjælp af i silico metoder. For nsP2 protease, forlængelse af substrat sekvens og reducere ioniske styrke buffer førte til en betydelig reduktion i Michaelis konstant spaltning af en Semliki Forest virus sekvens. Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at køre kontrolelementerne.
Substrater, der indeholder sekvenserne af virale proteasespaltningsstedssekvenser, skal testes, før SSHHPS-sekvensanalyse fortsættes. Hvis der observeres spaltning af et værtsprotein, skal der udføres opfølgende forsøg for at bekræfte, at værtsproteinet påvirker viral replikation. Dette kan gøres ved at overudse eller lukke munden på proteinet, og derefter undersøge virkningerne på viral replikation.
Gruppe IV indeholder et stort antal nye og fremspirende patogener. SSHHPS sekvenser forbinder specifikke værtsproteiner og veje med de virale proteaser på en meget forudsigelig måde.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
