Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Zebrabalığı Embriyolarında Situ Hibridizasyon ve IPSC-EC'lerde Tüp Oluşumu Nda Endoglin'in Vasküler Gelişimdeki Rolünü İncelemek İçin Tam Montaj
Chapters
Summary May 28th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Burada sunulan zebra balığı ve tüp oluşumu tahlil de hasta kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı endotel hücrelerinde tam montaj in situ RNA hibridizasyon analizi için bir protokol vasküler oluşumunda endoglin rolünü incelemektir.
Transcript
Tüm montaj, yerinde hibridizasyon, WISH, geleneksel yöntemlere göre yüksek çözünürlük ve düşük arka plan sonucu sağlar. Ayrıca, U-slayt plakaları fare embriyoları, Drosophila embriyolar ve diğer doku işlemek zor uygulanabilir daha az WISH kullanarak aynı odak uzaklığı odak geliştirmek. Tüp oluşumu tsay kök hücre farklılaştırılmış androjen hücrelerine uygulanabilir.
WISH mutasyon düzeltmesinin işlevsel anlamını anlamanızı kolaylaştırır. Prosedürü gösterecek kişi Yong Wang, laboratuvarımdan araştırma görevlisi. Mikroskop altında çalışarak, femtojet sistemini kullanarak tek hücreli embriyolara iki nanogram Morpholino ve 500 pikogram MRNA enjekte edin.
Morpholinos mikroenjeksiyonu başarıyla hücrelere enjekte ve yumurta bütünlüğünü korumak kadar birçok kez uygulama. Zigotları dechorionated kadar kuluçka ya da amaçlanan deneye karşılık gelen gelişme durumuna ulaşın. El yazmasının birinci tablosunda açıklandığı gibi.
Daha sonra, 1,5 mililitrelik bir tüp 20 ila 40 embriyo aktarmak için plastik bir pipet kullanın. Oda sıcaklığında bir mililitre taze hazırlanmış %4 PFA çözeltisi ekleyin. Embriyoları tamir ettikten, yıkadıktan ve susuz kattıktan sonra embriyoları alt kısmında naylon örgü bulunan bir elek yerleştirin.
Embriyoları sırayla %75 50 ve %25 metanol ile beşer dakika yıkayarak nemlendirin. Embriyoları PBST ile yıkadıktan sonra, embriyolarla birlikte tüpe 50 mikrolitre proteinaz K ekleyin. Sindirimden sonra, proteinaz K çıkarın ve beş dakika her zaman üç kez PBST ile embriyoları yıkayın.
Embriyolar ile her tüp içine karışık hedef probları 50 ila 100 mikrolitre ekleyin. Embriyoları bir gecede 40 derecede kuluçkaya yatırın. El yazmasında açıklandığı gibi embriyoları yıkadıktan sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca embriyoları onarmak için %4 paraformaldehit kullanın.
Daha sonra embriyoları oda sıcaklığında her seferinde 15 dakika boyunca üç kez 2x SSCT çözeltisinde yıkayın. SSCT çözeltisini çıkarın ve 50 mikrolitre Amp 1 ile değiştirin. Sonra embriyoları 40 derecede kuluçkaya yatırın.
30 dakika sonra, 2x SSCT çözeltisi içinde her seferinde 15 dakika oda sıcaklığında embriyoları üç kez yıkayın. SSCT çözeltisini çıkarın ve 50 mikrolitre Amp 2 ekleyin. 15 dakika kuluçkave daha önce olduğu gibi embriyo yıkama sonra, Amp 3 50 mikrolitre ekleyin ve yavaşça tüp dokunun.
Embriyoları 40 derecede kuluçkaya yatırın. 30 dakika sonra daha önce açıklandığı gibi embriyoları yıkayın. Sonra Amp 4 dropwise 50 mikrolitre ekleyin ve dikkatle tüp dokunun.
Daha sonra embriyoları 40 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın ve SSCT ile üç kez yıkayın. Embriyoları el yazmasında açıklandığı gibi görüntüleme için hazırladıktan sonra, numuneyi lekelemek için bir DAB peroksidaz substrat kiti kullanın. Bir mililitre distile suya A, B ve C renk reaktiflerinin her birini 50 mikrolitre ekleyin.
Ve tam bir DAB çalışma sıvısı elde etmek için iyice karıştırın. Sıvıyı numuneye ekleyin ve 10 dakika boyunca kapatın. Numuneleri iyice yıkadıktan sonra, onları görüntülemek için optik mikroskop kullanın.
HHT iPSCs kültür ve kontrol başlamak için, kuyuların alt kapsayacak şekilde altı iyi hücre kültürü plakaları için bodrum membran matris ekleyin. Plakaları 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kullanılan bodrum membran matris çözeltisini kuyulardan çıkarın ve her kuyuya iki mililitre mTeSR 1 orta ekleyin.
Daha sonra son geçitten alınan iPSC'leri yaklaşık 10'un katına, her kuyudaki altı hücreye kadar kesin. IPSC'leri yaklaşık dört gün boyunca biriktmeden sonra, hücre kültür ortamını tamamlayıcı BEL ortamıile değiştirin. Mezoderm hücreleri oluşturmak için üç gün boyunca hücreleri büyütün.
Vasküler endotel hücrelerini genişletmek için, dört gün boyunca takviye BEL orta ile orta değiştirin. Ve sonra aynı ortam ve kültür ile üç ila dört gün boyunca hücreleri tedavi. Kit talimatlarına göre CD31 Dynabeads kullanarak olgun vasküler endotel hücreleri arındırın.
Sonra elüsyon arabelleği tarafından CD31 pozitif hücreleri toplamak. VEGF165, bFGF ve FBS içeren EC-SFM ortamdasaflaştırılmış endotel hücrelerini koruyun ve genişletin. Endotel hücrelerini kaplamak için, anjiyogenez plakalarına her kuyuda 10 mikrolitre bazal membran matris ekleyerek başlayın.
Plakaları 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Endotel hücrelerini hasat edin ve tekrar tekrar borulandırarak endotel büyüme ortamı 2'de yeniden askıya alın. Her kuyudaki katılaşmış matrise bu hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresini ekleyin ve sonra hücreleri 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Kuluçka 3-5 saat sonra, endotel tüpü oluşumunu değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü bir mikroskop kullanın. Her grup için en az on alanın görüntülerini yakalayın. Genel tüp uzunluğunu, tüp numarasını ve dal noktalarını inceleyin.
CISH ve WISH 24 saat post-fertilizasyon embriyolarında endolin ekspresyonunu belirlemek için yapıldı. Endojen susturmanın etkisini incelemek için hemojenik endotel belirteci ve endotel atası belirteci kullanıldı. Kırmızı oklar, bu belirteçlerin, aplnrna ve npr1a'nın ifadesinin önemli ölçüde azaldığı bölgeleri gösterir.
Endotel tüpü oluşum satomu endoglin mutant ve kontrol iPSC kaynaklı endotel hücrelerinde yapıldı. Tüp oluşumu değerlendirildi ve üç saat sonra fotoğraflandı. Tüp uzunluğu, tüp numarası ve dallanma ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü.
Mutant endotel hücreleri kontrol endotel hücrelerinden daha az dal oluşturmuştur. Ve mutant endotel hücrelerinde dalları önemli ölçüde vasküler endotelyal büyüme faktörü ile stimülasyon sonra arttı. Bu yöntem aynı zamanda periferik kandan iPS üretimi için de kullanılabilir.
Ve yöntem le in vitro ve in vivo vasküler oluşumunda endokrin rolünü açıklar. Mutasyonun düzeltilmesinin anjiyogenezde bir fark yaratabileceğini bilerek, potansiyel kök hücre tedavisi için hücreleri hastalara geri nakletmek mümkündür.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
