Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Berigelse af pattedyrvæv og Xenopus Oocytter med kolesterol
Chapters
Summary March 25th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
To metoder til kolesterol berigelse præsenteres: anvendelse af cyclodextrin mættet med kolesterol til at berige pattedyr væv og celler, og brugen af kolesterol-beriget fosfolipid-baserede dispersioner (liposomer) til at berige Xenopus oocytter. Disse metoder er medvirkende til at bestemme virkningen af forhøjede kolesterolniveauer i molekylære, cellulære, og organfunktion.
Transcript
Forhøjet kolesterol er en væsentlig risikofaktor for hjerte-kar-og neurodegenerative sygdom. Vores protokoller giver værdifulde værktøjer til at studere både fysiologiske og mekanistiske konsekvenser af hyperkolesterolæmi. Disse procedurer kan udføres ved hjælp af grundlæggende lab udstyr, og gælder for celler, væv, og Xenopus oocytter.
Kolesterol er en vigtig komponent i cellulære membraner i hele kroppen. Disse teknikker kan udnyttes til at studere virkningen af forhøjede niveauer af kolesterol i enhver celletype. Dissekere arterierne er det sværeste skridt.
Fjern forsigtigt arterien fra hjernen, uden at strække eller beskadige det vaskulære væv. Lipider er meget delikat, og at arbejde med dem er mere af en kunst end en videnskab. Video demonstration giver en guide til at lære at håndtere lipider omhyggeligt.
For at forberede kolesterolmættet methyl-beta-cyclodextrin opløsning, først tilsættes 064 gram methyl-beta-cyclodextrin til 10 milliliter PBS, omrøring opløsningen med en røre bar, for at sikre, at methyl-beta-cyclodextrin fuldt opløses. Dernæst tilsættes 0024 gram kolesterol pulver til kolben, og rør opløsningen kraftigt, ved hjælp af en spatel til at bryde op så mange kolesterol stykker som muligt. Når næsten alle kolesterol er blevet opløst, forsegle kolben med mindst to lag paraffin film.
Og ryst kolben på omkring 30 svingninger i minuttet i en 37 grader Celsius vandbad natten over. Efter otte til 16 timer afkøles opløsningen til stuetemperatur, før blandingen filtreres gennem et 22 mikrometer polyethersulfon sprøjtefilter i en klasseflaske. For pattedyr cerebral arterie berigelse, høste hjernen fra en 250 til 300 gram Sprague Dawley rotte i et bæger af PBS på is, før overføre hjernen til en voksbehandlet dissektion skål, under en diserning mikroskop, der indeholder lige nok PBS at nedsænke vævet.
Fastgør hjernen med to til tre ben, og sørg for at de ikke trænger blodkarrene. Og bruge skarpe kraftbånd og små kirurgiske saks til forsigtigt dissekere cerebral arterier og deres grene, der danner Circle of Willis i bunden af hjernen. Dernæst skylles kortvarigt op til en centimeter lang arteriesegmenter i PBS, før de skyllede segmenter inkuberes i nok kolesterolberigende opløsning til at dække vævene.
For at bestemme eventuelle ændringer i kolesteroltallet, bruge en frisk flaske filipin pulver til at forberede en 10 milligram per milliliter bestand opløsning af farvestoffet i dimethylsulfoxid, og vask kolesterol beriget væv med tre fem minutters vasker i frisk PBS. Efter den sidste vask, fastgør arteriesegmenterne i 4% paraformaldehyd i 15 minutter på is, beskyttet mod lys, før permeabilizing prøverne i 5% Triton i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning vaskes vævet med tre fem minutters vask i PBS på en shaker, inden prøverne tilsættes til en slutkoncentration på 25 mikrogram pr. milliliter af filipinfarveopløsning i en time ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
Ved slutningen af inkubationen vaskes arteriestykkerne tre gange, efterfulgt af en kort skylning med destilleret vand. Efter den sidste vask, bruge en lab væv til at absorbere overskydende væske, og montere arterierne på et dias ved hjælp af en passende montering medium. Omhyggeligt dække arterierne med et dæksel slip, idet du skal passe på at undgå rullende eller vridning af vævet, og lad dias tørre i 24 timer ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
Når monteringsmediet er tørt, forsegles dækslets længdekanter med klar neglelak, og poleren tørres i 10 til 15 minutter. Derefter billede vævet med en excitation af 340 til 380 nanometer, og en emission på 385 til 470 nanometer. For at forberede fosfolipid baseret dispersion, kombinere 200 mikroliter af 10 milligram per milliliter chloroform opløst lipid opløsning, L-alpha-phosphatidylethanolamin, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosforcholin, og kolesterol i en 12 milliliter glasrør.
Fordampechloroformen i emhætten under en nitrogenstrøm, før lipiderne suspenderes i 800 mikroliter af bufferet 150 millimolar kaliumchlorid og 10 millimolar Tris HEPES opløsning. Derefter forsegle røret med paraffin film, og forsigtigt sonikere rørindholdet på 80 kilohertz i 10 minutter, indtil en mælkeagtig blanding er dannet. For kolesterol berigelse af Xenopus oocytter, bruge skarpe kraftbefæstelser til at forstyrre æggestokkene sæk fra en kvindelig Xenopus laevis frøen i flere regioner, og placere æggestokkene stykker i en 60 millimeter plade med fem milliliter calciumfri ND96 suppleret med 5 milligram pr. milliliter kollagenase.
Ryst vævet på en orbital shaker ved 60 svingninger i minuttet i 15 minutter ved stuetemperatur. Ved slutningen af inkubationen skal du bruge en overførselspipette med en bred spids til kraftigt at pipette den oocytholdige opløsning fem til 10 gange for at isolere de enkelte oocytter og skyl hurtigt den mørke oocytopløsning med frisk calciumfri ND96, indtil opløsningen bliver gennemsigtig. Dernæst overføre 90 mikroliter af kolesterol beriget fosfolipid baseret dispersion i en brønd af en 96 brønd plade, og tilføje op til seks oocytter til brønden med så lidt medium som muligt.
Placer 96 godt plade på en tredimensionel platform rotator i fem til 10 minutter. Derefter tilføje en dråbe ND96 til brønden, og overføre kolesterol beriget oocytter til en 35 millimeter plade, der indeholder ND96 for deres umiddelbare analyse. Her, et eksempel på en afbildet cerebral arterie glat muskel lag viser koncentrationen afhængige stigning i filipin associeret fluorescens opnået ved væv berigelse med stigende koncentrationer af kolesterol.
Især tre timer efter behandlingen med methyl-beta-cyclodextrin kolesterol kompleks kolesterol niveauer faldt med ca 50% i forhold til deres niveau umiddelbart efter berigelse. Mens en time inkubationstid er almindeligt anvendt til at berige væv og celler med kolesterol i løbet af denne tilgang, fem minutters inkubation er normalt tilstrækkelig til at opnå en statistisk signifikant stigning i cerebral arteriel kolesterol indhold som bestemt af kolesterol oxidase baseret biokemisk analyse. Mens ingen væsentlig ændring er observeret i kolesterolniveauer i Xenopus oocytter beriget med kontrol fosfolipid baseret dispersioner mangler kolesterol, kolesterolniveauer stige betydeligt efter kun fem minutters behandling med fosfolipid baseret dispersioner, der omfatter kolesterol, og forblive på dette niveau, når inkubationstiden øges til 60 minutter.
Effektiviteten af den cyclodextrinbaserede tilgang til berigende celler er også påvist i neuroner, der er frisk isoleret fra HIPPOcampus ca. Faktisk, inkubation af neuroner i methyl-beta-cyclodextrin mættet med kolesterol i 60 minutter resulterer i en over to gange stigning i kolesteroltallet, vurderet af filipin tilhørende fluorescens. Samlet set er de to vigtigste skridt for disse procedurer forbereder kolesterol berigelse blandingen og sikre integriteten af arteriel væv.
Efter kolesterol berigelse, kan man studere funktionen af de proteiner, der er påvirket af hyperkolesterolæmi. Evnen til at berige celler med kolesterol lettet studiet af forhøjede kolesterolniveauer i kardiomyocytter og neuroner. Brugen af oocytter tillod os at undersøge, hvordan kolesterol binder sig til ionkanaler.
En laboratoriekittel og handsker hun altid være slidt for denne protokol. Chloroform og paraformaldehyd skal anvendes under emhætte og kasseres som farligt affald.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
