Login processing...

JoVE Journal
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Biochemistry

Berikelse av pattedyrvev og Xenopus oocytter med kolesterol

Analysis of β-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Journal (Biochemistry)

Analysis of β-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Journal (Biochemistry)

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Click here for the English version

Berikelse av pattedyrvev og Xenopus oocytter med kolesterol

Article DOI: 10.3791/60734-v

March 25th, 2020 •

Alexandria Slayden¹, Kelsey North¹, Shivantika Bisen¹, Alex M. Dopico¹, Anna N. Bukiya¹, Avia Rosenhouse-Dantsker²

¹Department of Pharmacology, Addiction Science and Toxicology, The University of Tennessee HSC, ²Department of Chemistry, University of Illinois at Chicago

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

March 25th, 2020

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

To metoder for kolesterol berikelse presenteres: anvendelsen av cyklodextrin mettet med kolesterol for å berike pattedyr vev og celler, og bruk av kolesterolberiket fosfolipid-baserte dispersjoner (liposomer) for å berike Xenopus oocytes. Disse metodene er instrumentelle for å bestemme virkningen av forhøyede kolesterolnivåer i molekylær, cellulær og organfunksjon.

Transcript

Forhøyet kolesterol er en viktig risikofaktor for kardiovaskulær og nevrodegenerativ sykdom. Våre protokoller gir verdifulle verktøy for å studere både fysiologiske og mekanistiske konsekvenser av hyperkolesterolemi. Disse prosedyrene kan utføres ved hjelp av grunnleggende laboratorieutstyr, og gjelder for celler, vev og Xenopus oocytes.

Kolesterol er en viktig komponent i cellulære membraner i hele kroppen. Disse teknikkene kan benyttes til å studere virkningen av forhøyede nivåer av kolesterol i enhver celletype. Dissekere arteriene er det vanskeligste trinnet.

Fjern forsiktig arterien fra hjernen, uten å strekke eller skade vaskulært vev. Lipider er veldig delikate, og å jobbe med dem er mer av en kunst enn en vitenskap. Videodemonstrasjon gir en veiledning for å lære å håndtere lipider nøye.

For å forberede kolesterolet mettet metyl-beta-cyclodextrin løsning, først legge til 064 gram metyl-beta-cyclodextrin til 10 milliliter PBS, rør løsningen med en røre bar, for å sikre at methyl-beta-cyclodextrin oppløses fullt ut. Deretter legger du til 0024 gram kolesterolpulver til kolben, og rør løsningen kraftig, ved hjelp av en slikkepott for å bryte opp så mange kolesterolbiter som mulig. Når nesten alt kolesterolet er oppløst, forsegle kolben med minst to lag parafinfilm.

Og rist kolben på ca 30 svingninger per minutt i et 37 graders Celsius vannbad over natten. Etter åtte til 16 timer avkjøles oppløsningen til romtemperatur, før du filtrerer blandingen gjennom et 22 mikrometerpolyeterpolyetersulfonsprøytefilter i en klasseflaske. For pattedyr cerebral arterie berikelse, høst hjernen fra en 250 til 300 gram Sprague Dawley rotte inn i et beger av PBS på is, før du overfører hjernen til en vokset disseksjon bolle, under et dissekere mikroskop, som inneholder akkurat nok PBS til å senke vevet.

Sikre hjernen med to til tre pinner, og pass på at de ikke trenger inn i blodårene. Og bruk skarpe tang og liten kirurgisk saks for å forsiktig dissekere hjernearteriene og deres grener som danner Circle of Willis ved foten av hjernen. Deretter skyller du opptil en centimeter lange arteriesegmenter i PBS, før du inkuberer de skyllede segmentene i nok kolesterolberikende løsning for å dekke vevet.

For å bestemme eventuelle endringer i kolesterolnivået, bruk en ny flaske filippinsk pulver for å forberede en 10 mg per milliliter lagerløsning av fargestoffet i dimetylsulfoksid, og vask kolesterolberiket vev med tre fem minutters vasker i friske PBS. Etter siste vask, fest arteriesegmentene i 4% paraformaldehyd i 15 minutter på is, beskyttet mot lys, før de gjennomsyrer prøvene i 5% Triton i PBS i 10 minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen vasker vevet med tre fem minutters vasker i PBS på en shaker, før du legger prøvene til et 25 mikrogram per milliliter endelig konsentrasjon av filipinfargeløsning, i en time ved romtemperatur, beskyttet mot lys.

På slutten av inkubasjonen vasker du arteriebitene tre ganger som demonstrert, etterfulgt av en kort skyll med destillert vann. Etter siste vask, bruk et laboratorievev for å absorbere overflødig væske, og monter arteriene på et lysbilde ved hjelp av et passende monteringsmedium. Dekk forsiktig arteriene med en dekselslipp, vær forsiktig for å unngå å rulle eller vri vevet, og la lysbildet tørke i 24 timer ved romtemperatur, beskyttet mot lys.

Når monteringsmediet er tørt, forsegler du dekselets sklikanter med klar neglelakk, og la polishen tørke i 10 til 15 minutter. Deretter kan du se for deg vevet med en eksitasjon på 340 til 380 nanometer, og et utslipp på 385 til 470 nanometer. For å forberede fosfolipidbasert dispersjon, kombiner 200 mikroliter på 10 mg per milliliter kloroform oppløst lipidløsning, L-alfa-fosfosyletanolamin, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfolkolin og kolesterol i et 12 milliliter glassrør.

Fordampe kloroformen i hetten under en strøm av nitrogen, før du suspenderer lipidene i 800 mikroliter bufret 150 millimolar kaliumklorid og 10 millimolar Tris HEPES-løsning. Forsegle deretter røret med parafinfilm, og soniker forsiktig rørinnholdet på 80 kilohertz i 10 minutter, til en melkeaktig blanding dannes. For kolesterolberikelse av Xenopus oocytes, bruk skarpe tang for å forstyrre eggstokksekken fra en kvinnelig Xenopus laevis frosk i flere regioner, og legg eggstokkbitene i en 60 millimeter plate med fem milliliter kalsiumfri ND96 supplert med 5 milligram per milliliter kollagennase.

Rist vevet på en orbital shaker ved 60 svingninger per minutt i 15 minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, bruk en overføringpipette med en bred spiss for å kraftig pipette oocyte som inneholder løsningen fem til 10 ganger for å isolere de enkelte oocytes, og skyll raskt den mørke oocyteløsningen med fersk kalsiumfri ND96 til løsningen blir gjennomsiktig. Deretter overfører du 90 mikroliter av kolesterolberiket fosfolipdbasert dispersjon til en brønn av en 96-brønnplate, og legger til opptil seks oocytter til brønnen med så lite medium som mulig.

Plasser 96-brønnplaten på en tredimensjonal plattformrotator i fem til ti minutter. Legg deretter til en dråpe ND96 til brønnen, og overfør kolesterolberikede oocytter til en 35 millimeter plate som inneholder ND96 for deres umiddelbare analyse. Her viser et eksempel på en avbildet cerebral arterie glatt muskellag den konsentrasjonsavhengige økningen i filipin assosiert fluorescens oppnådd ved vevsberikelse med økende konsentrasjoner av kolesterol.

Spesielt tre timer etter behandlingen med metyl-beta-cyclodextrin kolesterol kompleks kolesterolnivået redusert med ca 50%sammenlignet med deres nivå umiddelbart etter berikelsen. Mens en time inkubasjonstid ofte brukes til å berike vev og celler med kolesterol under denne tilnærmingen, er fem minutter inkubasjon vanligvis tilstrekkelig til å oppnå en statistisk signifikant økning i cerebral arterielt kolesterolinnhold som bestemmes av kolesteroloksidasebasert biokjemisk analyse. Mens ingen signifikant endring observeres i kolesterolnivåer i Xenopus oocytes beriket med kontroll fosfolipd baserte dispersjoner mangler kolesterol, kolesterolnivået øker betydelig etter bare fem minutters behandling med fosfolippid baserte dispersjoner som inkluderer kolesterol, og forblir på dette nivået når inkubasjonstiden økes til 60 minutter.

Effektiviteten av cyclodextrin basert tilnærming for berikende celler er også demonstrert i nevroner ferskt isolert fra CA1-regionen i hippocampus. Faktisk resulterer inkubasjon av nevronene i metyl-beta-cyclodextrin mettet med kolesterol i 60 minutter i en over to ganger økning i kolesterolnivåer, som vurdert av filipin assosiert fluorescens. Samlet sett forbereder de to viktigste trinnene for disse prosedyrene kolesterolberikelseblandingen og sikrer integriteten til arterielt vev.

Etter kolesterolberikelse kan man studere funksjonen til proteinene som påvirkes av hyperkolesterolemi. Evnen til å berike celler med kolesterol tilrettelagt studiet av forhøyede kolesterolnivåer i kardiomyocytter og nevroner. Bruken av oocytes tillot oss å undersøke hvordan kolesterol binder seg til ionkanaler.

En lab frakk og hansker hun alltid brukes for denne protokollen. Kloroform og paraformaldehyd skal brukes under en røykhette og kastes som farlig avfall.

X

Simple Hit Counter