Biochemistry
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Enriquecimento de Tecidos mamíferos e Oócitos xenopus com colesterol
Chapters
Summary March 25th, 2020
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Dois métodos de enriquecimento do colesterol são apresentados: a aplicação de ciclodextrina saturada com colesterol para enriquecer tecidos e células de mamíferos, e o uso de dispersões à base de fosfolipídeos enriquecidos com colesterol (lipossos) para enriquecer os oócitos xenopus. Esses métodos são fundamentais para determinar o impacto de níveis elevados de colesterol na função molecular, celular e de órgãos.
Transcript
O colesterol elevado é um dos principais fatores de risco para doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. Nossos protocolos fornecem ferramentas valiosas para estudar as consequências fisiológicas e mecanicistas da hipercolesterolemia. Esses procedimentos podem ser realizados usando equipamentos básicos de laboratório, e são aplicáveis a células, tecidos e oócitos xenopus.
O colesterol é um componente importante das membranas celulares em todo o corpo. Essas técnicas podem ser utilizadas para estudar o impacto de níveis elevados de colesterol em qualquer tipo de célula. Dissecar as artérias é o passo mais difícil.
Remova cuidadosamente a artéria do cérebro, sem esticar ou danificar o tecido vascular. Lipídios são muito delicados, e trabalhar com eles é mais uma arte do que uma ciência. A demonstração de vídeo fornece um guia para aprender a lidar com lipídios com cuidado.
Para preparar a solução de metila-beta-ciclodextrina saturada de colesterol, adicione primeiro 064 gramas de metil-beta-ciclodextrina a 10 mililitros de PBS, agitando a solução com uma barra de agitação, para garantir que a metil-beta-ciclodextrina se dissolva totalmente. Em seguida, adicione 0024 gramas de pó de colesterol ao frasco, e mexa a solução vigorosamente, usando uma espátula para quebrar o maior número possível de pedaços de colesterol. Quando quase todo o colesterol tiver sido dissolvido, sele o frasco com pelo menos duas camadas de filme de parafina.
E agitar o frasco a cerca de 30 oscilações por minuto em um banho de água de 37 graus Celsius durante a noite. Depois de oito a 16 horas, esfrie a solução à temperatura ambiente, antes de filtrar a mistura através de um filtro de seringa de poliésterulfone de 22 micrômetros em uma garrafa de classe. Para o enriquecimento da artéria cerebral dos mamíferos, colhia o cérebro de um rato Sprague Dawley de 250 a 300 gramas em um béquer de PBS no gelo, antes de transferir o cérebro para uma tigela de dissecção encerada, sob um microscópio dissecando, contendo apenas PBS suficiente para submergir o tecido.
Proteja o cérebro com dois a três pinos, certificando-se de que eles não penetrem vasos sanguíneos. E use fórceps afiados e pequenas tesouras cirúrgicas para dissecar suavemente as artérias cerebrais e seus ramos que formam o Círculo de Willis na base do cérebro. Em seguida, enxágue brevemente até um centímetro de comprimento dos segmentos da artéria na PBS, antes de incubar os segmentos enxaguados em solução suficiente de enriquecimento de colesterol para cobrir os tecidos.
Para determinar quaisquer alterações no nível de colesterol, use uma garrafa fresca de pó de filipina para preparar uma solução de estoque de 10 miligramas por mililitro do corante em sulfóxido de dimetil, e lave os tecidos enriquecidos de colesterol com três lavagens de cinco minutos em PBS fresco. Após a última lavagem, fixe os segmentos da artéria em 4% de paraformaldeído por 15 minutos no gelo, protegido da luz, antes de permeabilizar as amostras em 5% Triton em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, lave os tecidos com três lavagens de cinco minutos em PBS em um shaker, antes de adicionar as amostras a uma concentração final de 25 microgramas por mililitro de solução de corante filipina, por uma hora à temperatura ambiente, protegida da luz.
No final da incubação, lave as peças da artéria três vezes como demonstrado, seguida de uma breve lavagem com água destilada. Após a última lavagem, use um tecido de laboratório para absorver qualquer excesso de líquido e monte as artérias em um slide usando um meio de montagem apropriado. Cubra cuidadosamente as artérias com um deslizamento de tampa, tomando cuidado para evitar enrolar ou torcer o tecido, e deixe o slide secar por 24 horas em temperatura ambiente, protegido da luz.
Quando o meio de montagem estiver seco, sele as bordas de deslizamento de tampa com esmalte claro e deixe o polimento secar por 10 a 15 minutos. Em seguida, imagem do tecido com uma excitação de 340 a 380 nanômetros, e uma emissão de 385 a 470 nanômetros. Para preparar a dispersão à base de fosfolipídid, combine 200 microliters de 10 mililígenos por solução lipídica dissolvida por clorofórmio mililitro, L-alfa-fosfatidylethanolamina, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfosphocholine, e colesterol em um tubo de vidro de 12 mililitro.
Evaporar o clorofórmio no capô sob um fluxo de nitrogênio, antes de suspender os lipídios em 800 microliters de 150 milialares de cloreto de potássio e 10 milimilas solução Tris HEPES. Em seguida, sele o tubo com filme de parafina e sonicar suavemente o conteúdo do tubo a 80 kilohertz por 10 minutos, até formar uma mistura leitosa. Para o enriquecimento de colesterol de oócitos xenopus, use fórceps afiados para interromper o sacuto ovariano de um sapo xenopus laevis fêmea em várias regiões, e coloque os pedaços de ovário em uma placa de 60 milímetros com cinco mililitros de ND96 livre de cálcio suplementados com 5 miligramas por mililitro de colagenase.
Agite o tecido em um agitador orbital a 60 oscilações por minuto durante 15 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, use uma pipeta de transferência com uma ponta larga para pipetar vigorosamente o oócito contendo solução de cinco a dez vezes para isolar os oócitos individuais, e enxaguar rapidamente a solução de oócito escuro com nd96 fresco livre de cálcio até que a solução se torne transparente. Em seguida, transfira 90 microlitadores do colesterol enriquecido dispersão à base de fosfolipídio em um poço de uma placa de poço 96, e adicione seis oócitos ao poço com o mínimo possível.
Coloque a placa 96 em um rotador de plataforma tridimensional por cinco a 10 minutos. Em seguida, adicione uma gota de ND96 ao poço, e transfira os oócitos enriquecidos de colesterol para uma placa de 35 milímetros contendo ND96 para sua análise imediata. Aqui, um exemplo de uma camada muscular lisa da artéria cerebral imagem demonstra o aumento dependente da concentração na fluorescência associada à filipina obtida após o enriquecimento tecidual com concentrações crescentes de colesterol.
Notavelmente três horas após o tratamento com o complexo de colesterol metil-beta-ciclodextrina, os níveis de colesterol diminuíram aproximadamente 50% em comparação com seu nível imediatamente após o enriquecimento. Embora um tempo de incubação de uma hora seja comumente usado para enriquecer os tecidos e células com colesterol durante essa abordagem, cinco minutos de incubação são geralmente suficientes para alcançar um aumento estatisticamente significativo no teor de colesterol arterial cerebral, determinado pelo ensaio bioquímico baseado em colesterol oxidase. Embora nenhuma mudança significativa seja observada nos níveis de colesterol em Xenopus oócitos enriquecidos com dispersões à base de fósforo de controle sem colesterol, os níveis de colesterol aumentam significativamente após apenas cinco minutos de tratamento com as dispersões à base de fosfolipídid que incluem colesterol, e permanecem neste nível quando o tempo de incubação é aumentado para 60 minutos.
A eficácia da abordagem baseada em ciclodextrina para células enriquecedoras também é demonstrada em neurônios recém-isolados da região do CA1 do hipocampo. De fato, a incubação dos neurônios na metil-beta-ciclodextrina saturada de colesterol por 60 minutos resulta em um aumento de mais de duas vezes nos níveis de colesterol, conforme avaliado pela fluorescência associada à filipina. No geral, os dois passos mais importantes para esses procedimentos são preparar a mistura de enriquecimento de colesterol e garantir a integridade do tecido arterial.
Após o enriquecimento do colesterol, pode-se estudar a função das proteínas que são afetadas pela hipercolesterolemia. A capacidade de enriquecer células com colesterol facilitou o estudo de níveis elevados de colesterol em cardiomiócitos e neurônios. O uso de oócitos nos permitiu investigar como o colesterol se liga aos canais de íons.
Um jaleco e luvas que ela sempre usa para este protocolo. Clorofórmio e paraformaldeído devem ser usados sob um capô de fumaça e serem descartados como resíduos perigosos.
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