Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Strategische screening en karakterisering van de Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex voor succesvolle kristallisatie
Summary March 16th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dit rapport beschrijft de screening van verschillende detergenten voor de voorbereiding van de visuele GPCR, rododenine, en het complex met mini-Go. Biochemische methoden die de kwaliteit van het complex in verschillende stadia tijdens de zuivering karakteriseren, worden gedemonstreerd. Dit protocol kan worden gegeneraliseerd naar andere membraan eiwitcomplexen voor hun toekomstige structurele studies.
Transcript
Signaaltransductie is een van de belangrijkste onderwerpen in biologisch en farmaceutisch onderzoek. Het vereist membraaneiwitten om signalen naar hun intracellulaire signaleringspartnereiwit over te brengen. Dit protocol is ontworpen om een systematische wasmiddelscreening uit te voeren ter voorbereiding van een signaleringscomplex gericht op structuurbepaling.
Dit protocol maakt gebruik van algemeen beschikbare technieken in een gevestigde biologie laboratorium en gemakkelijk worden uitgevoerd door de beginners in het veld. We omvatten deze methoden om de meest kritische parameter te vinden in de voorbereiding van membraan eiwit complex. Om te beginnen ontdooit u 30 gram HEK293 GNT I-deficiënte celpellet tot kamertemperatuur en breng deze over op een beker.
Voeg 120 milliliter PBS-buffer toe met proteaseremmercocktail en homogeen met behulp van een Dounce-homogenisator of een elektrische homogenisator bij 13.000 RPM gedurende 30 seconden. Pas het volume aan op 150 milliliter met PBS-buffer. Voeg voorzichtig 10%DDM toe aan de gehomogeniseerde cellen om een laatste concentratie van 1,25% een uur lang op ijs te roeren.
Na oplossing, centrifugeren de cel lysaat op vier graden Celsius en 150,000 keer G gedurende 45 minuten om de onoplosbare puin te verwijderen. Breng de supernatant over op een fles van 500 milliliter en voeg 10 milliliter van de 50%1D4 immuno-affinity agarose hars toe. Meng het oplosbaar cellysaat en hars vier uur of 's nachts bij vier graden Celsius voorzichtig om eiwitbinding mogelijk te maken.
Laad het lysaat harsmengsel in een open kolom om de hars te verzamelen. Was de hars met 10 kolomvolumes wasbuffer A om de eiwitverontreiniging te verwijderen. Sluit de klep en resuspend de hars met twee kolomvolumes van buffer A.Next, onder schemerarm rood licht, voeg 9-cis Retinal aan de geresuspendeerde hars aan een definitieve concentratie van 50 micromolar.
Meng zachtjes op vier graden Celsius gedurende vier tot 16 uur in het donker voor Retinale binding. Open daarna de waarde en verwijder de buffer uit de kolom. Was hars met 20 kolomvolumes van buffer A, gevolgd door 15 kolomvolumes van buffer B om niet-gebonden Retinal te verwijderen.
Resuspend de hars in twee kolomvolumes van buffer B en verdeel de harssusopening evengoed tot 10 10 milliliter verwijderingskolommen. Verwijder de buffer uit de 10 kolommen en vervolgens resuspend de hars elk in een milliliter buffer C voor detergent change. Een uur lang incuberen op ijs.
Herhaal de was en de incubatie in buffer C nog een keer. Verwijder de buffer uit de kolommen en zet de hars opnieuw op in 0,8 milliliter elutiebuffer voor elke kolom. Meng zachtjes gedurende twee uur.
Verzamel de elutie van elke kolom in een buis. Resuspend de hars in 0,7 milliliter elutie buffer voor elke kolom. Meng voorzichtig gedurende een uur.
Verzamel de elutie van elke kolom in dezelfde buizen. Laad in het donker het ontweken eiwit op de kwartsvvette. Meet het spectrum van het eiwitmonster.
Verlicht het eiwit direct in de cuvette gedurende twee minuten met licht passeren van 495 nanometer long pass filter. Meet het spectrum van het verlichte monster. Voer dezelfde meting uit voor alle eiwitmonsters gezuiverd in de andere negen detergenten.
Zowel donkere als verlichte toestanden. Bij normaal licht, voor elke wasmiddel voorwaarde bereiden 100 microliter rhodopsine op 0,7 milligram per milliliter. Onder zwak rood licht, bereiden 100 microliter mengsel van rhodopsine op 0,7 milligram per milliliter en mini-GO op 0,2 milligram per milliliter.
Vul het mengsel aan met één millimolar magnesiumchloride. Verlicht het mengsel met licht van een 495 nanometer long pass filter en incubeer gedurende 30 minuten. Breng de monsters over op de flacons van de automonsternemers en plaats ze in de monsterlade.
Programmeer een methodebestand om sequentiële SEC-runs voor elk monster te automatiseren, waarbij de automatische sampler 77 microliter van het monster laadt naar de kolom en de reiniger 25 milliliter SEC-buffer per run ontwijkt. Noteer de absorptie op 280 nanometer en 380 nanometer. Verzamel de piekfracties van rhodopsine en rhodopsin-mini-GO complex bij het retentievolume rond 12,9 milliliter.
Analyseer de linker rhodopsine monsters en de piekfracties van rhodopsin-mini-GO complex op vier tot 12% SDS denatureren gradiënt gels met Coomassie blauwe vlekken. Bereid een 200 microliter mengsel van rhodopsine op een milligram per milliliter en PNGase F op 0,01 milligram per milliliter. Meng goed en broeden op ijs 's nachts.
Bereid een 200 microliter mengsel van rhodopsine op een milligram per milliliter en Endo F1-13 op 0,01 milligram per milliliter. Meng goed en broeden op ijs 's nachts. Analyseer het spijsverteringsresultaat door SDS-Page en Coomassie blauwe vlekken.
In deze studie leverde kleinschalige zuiveringsopstelling voldoende eiwitten op voor verdere analyses. Ultraviolet zichtbare spectra van rhodopsine tonen de donkere toestand 9-cis Retinale gebonden rhodopsine in blauwe rondingen. Na verlichting wordt 9-cis Retinal gedeproteineerd en wordt het in alle trans-Retinale gedeproereerd.
De verhoudingen van absorptiemiddelen op 280 nanometer over absorptiets 488 nanometer en absorptiemiddelen op 280 nanometer over absorptiemiddelen op 380 nanometer tonen de stabiliteit van rhodopsine gezuiverd in elk wasmiddel. Grootte uitsluiting chromatografie profielen van rhodopsine en rhodopsin-mini-GO complex gezuiverd in 10 verschillende detergenten worden hier weergegeven. Het profiel van de standaard marker eiwitten wordt samen met het DDM monster als overlay weergegeven.
De interpretatie van de piekprofielen wordt getoond voor DMNG met het ideale scenario voor DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 en OGNG. Het vergroot profiel van het OGNG-monster toont zowel rhodopsine als rhodopsine-mini-GO-complex ontgaan rond hetzelfde retentievolume. De SDS-Page analyse van rhodopsine en SEC gezuiverde monsters van rhodopsin-mini-GO complex wordt hier getoond.
Deze figuur toont de SDS-Page analyse van rhodopsine deglycosylation met Endo F1 en PNGase F enzymen. Het is van cruciaal belang om wasmiddelscreening op een systematische manier uit te voeren, zodat de impact van elk individueel wasmiddel duidelijk kan worden vergeleken zonder dubbelzinnigheid. Voor eiwitten van verschillende hoeveelheden kan thermische verschuivingstest ook worden gebruikt om de impact van wasmiddel op de eiwitstabiliteit te bestuderen.
Dankzij deze methode zijn we in staat om stabiel eiwitcomplex te bereiden en uiteindelijk de kristalstructuur op te lossen die verloren gaat in geo-assemblage. Het gaf belangrijke inzichten in GPCR-G eiwit interactie specificiteit.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE