Biochemistry
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सफल क्रिस्टलीकरण के लिए विजुअल जीपीसीआर-मिनी-जी प्रोटीन सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स की रणनीतिक स्क्रीनिंग और लक्षण वर्णन
Summary March 16th, 2020
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इस रिपोर्ट में विजुअल जीपीसीआर, रोडोप्सिन और मिनी-जीओके साथ इसके कॉम्प्लेक्स को तैयार करने के लिए विभिन्न डिटर्जेंट की स्क्रीनिंग का वर्णन किया गया है । शुद्धिकरण के दौरान विभिन्न चरणों में परिसर की गुणवत्ता की विशेषता वाले जैव रासायनिक तरीकों का प्रदर्शन किया जाता है। इस प्रोटोकॉल को उनके भविष्य के संरचनात्मक अध्ययनों के लिए अन्य झिल्ली प्रोटीन परिसरों में सामान्यीकृत किया जा सकता है।
Transcript
सिग्नल ट्रांसडक्शन जैविक और दवा अनुसंधान में सबसे महत्वपूर्ण विषयों में से एक है। यह झिल्ली प्रोटीन की आवश्यकता है उनके इंट्रासेलुलर सिग्नलिंग साथी प्रोटीन के लिए संकेत संचारित करने के लिए । यह प्रोटोकॉल संरचना निर्धारण के लिए लक्ष्य एक सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स की तैयारी में एक व्यवस्थित डिटर्जेंट स्क्रीनिंग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
यह प्रोटोकॉल एक अच्छी तरह से स्थापित जीव विज्ञान प्रयोगशाला में आमतौर पर उपलब्ध तकनीकों का उपयोग करता है और क्षेत्र में शुरुआती लोगों द्वारा आसानी से किया जाता है। झिल्ली प्रोटीन परिसर की तैयारी में सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर खोजने के लिए हमने इन तरीकों को शामिल किया। शुरू करने के लिए, कमरे के तापमान के लिए HEK293 GNT I-कमी सेल गोली के 30 ग्राम गल और यह एक बीकर को स्थानांतरित ।
30 सेकंड के लिए 13, 000 आरपीएम पर एक Dounce समरूप या एक इलेक्ट्रिक समरूप का उपयोग कर प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल और समरूप युक्त पीबीएस बफर के 120 मिलीलीटर जोड़ें। पीबीएस बफर के साथ 150 मिलीलीटर के लिए मात्रा समायोजित करें। धीरे-धीरे समरूप कोशिकाओं में 10% डीडीएम जोड़ें ताकि एक घंटे के लिए बर्फ पर 1.25% हलचल की अंतिम एकाग्रता दे सके।
घुलनशीलता के बाद, बिना दिवालिया मलबे को हटाने के लिए सेल को चार डिग्री सेल्सियस और 150, 000 बार जी को 45 मिनट के लिए देखा जाता है। सुपरनेट को 500 मिलीलीटर की बोतल में स्थानांतरित करें और 50% 1D4 इम्यूनो-एफ़िनिटी एगरल्ड राल के 10 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे-धीरे घुलनशील कोशिका को चार घंटे या रात भर के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर मिलाएं ताकि प्रोटीन बाइंडिंग की अनुमति दी जा सके।
राल को इकट्ठा करने के लिए एक खुले कॉलम में lysate राल मिश्रण लोड करें। प्रोटीन संदूषक को हटाने के लिए वॉश बफर ए के 10 कॉलम वॉल्यूम के साथ राल धोएं। वाल्व को बंद करें और डिम रेड लाइट कंडीशन के तहत बफर ए नेक्स्ट के दो कॉलम वॉल्यूम के साथ राल को फिर से रीसस्ट करें, 50 माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता में 9-सीआईएस रेटिना को पुनः निलंबित राल में जोड़ें।
रेटिना बाइंडिंग के लिए अंधेरे में चार से 16 घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर धीरे से मिलाएं । उसके बाद, मान खोलें और कॉलम से बफर निकालें। बफर ए के 20 कॉलम वॉल्यूम के साथ राल धोएं, इसके बाद अनबाउंड रेटिना को हटाने के लिए बफर बी के 15 कॉलम वॉल्यूम हैं ।
रेज़न को बफर बी के दो कॉलम वॉल्यूम में फिर से खर्च करें और फिर राल निलंबन को समान रूप से 10 10 मिलीलीटर निपटान कॉलम में विभाजित करें। 10 कॉलम से बफर निकालें और फिर डिटर्जेंट परिवर्तन के लिए बफर सी के एक मिलीलीटर में राल प्रत्येक को फिर से खर्च करें। बर्फ पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट।
एक बार और बफर सी में धुलाई और इनक्यूबेशन दोहराएं। कॉलम से बफर निकालें और फिर प्रत्येक कॉलम के लिए एल्यूशन बफर के 0.8 मिलीलीटर में राल को फिर से खर्च करें। धीरे-धीरे दो घंटे के लिए मिलाएं।
प्रत्येक कॉलम से एक ट्यूब में एल्यूशन ले लीजिए। प्रत्येक कॉलम के लिए 0.7 मिलीलीटर एल्यूशन बफर में राल को फिर से खर्च करें। धीरे-धीरे एक घंटे के लिए मिलाएं।
प्रत्येक कॉलम से एक ही ट्यूब में एल्यूशन ले लीजिए। अंधेरे में, क्वार्ट्ज क्यूवेट में नहीं मिल रहे प्रोटीन को लोड करें। प्रोटीन नमूने के स्पेक्ट्रम को मापें।
प्रोटीन को सीधे क्यूवेट में दो मिनट के लिए 495 नैनोमीटर लंबे पास फिल्टर के माध्यम से हल्के पास के साथ रोशन करें। प्रबुद्ध नमूने के स्पेक्ट्रम को मापें। अन्य नौ डिटर्जेंट में शुद्ध सभी प्रोटीन नमूनों के लिए एक ही माप करें।
दोनों अंधेरे और प्रबुद्ध राज्यों। सामान्य प्रकाश के तहत, प्रत्येक डिटर्जेंट स्थिति के लिए 0.7 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर पर रोडोप्सिन के 100 माइक्रोलीटर तैयार करते हैं। मंद लाल बत्ती के तहत, 0.7 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर पर रोडोप्सिन के मिश्रण के 100 माइक्रोलीटर तैयार करें और मिनी-गो 0.2 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर पर।
मिश्रण को एक मिलीमोलर मैग्नीशियम क्लोराइड के साथ पूरक करें। मिश्रण को 495 नैनोमीटर लंबे पास फिल्टर से प्रकाश के साथ रोशन करें और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। नमूनों को ऑटो पारखी शीशियों में स्थानांतरित करें और उन्हें नमूना ट्रे में रखें।
प्रोग्राम अनुक्रमिक एसईसी को स्वचालित करने के लिए एक विधि फ़ाइल प्रत्येक नमूने के लिए ऑटो-पारखी लोडिंग के साथ कॉलम में नमूने के 77 माइक्रोलीटर लोड करता है और प्रति रन एसईसी बफर के 25 मिलीलीटर को प्यूरीफायर करता है। 280 नैनोमीटर और 380 नैनोमीटर पर अवशोषण रिकॉर्ड करें। 12.9 मिलीलीटर के आसपास प्रतिधारण मात्रा में रोडोप्सिन और रोडोप्सिन-मिनी-गो कॉम्प्लेक्स के शिखर अंशों को इकट्ठा करें।
बाएं रोडोप्सिन नमूनों और चार से 12% एसडीएस पर रोडोप्सिन-मिनी-गो कॉम्प्लेक्स के शिखर अंशों का विश्लेषण करें, जो कूमासी ब्लू स्टेनिंग के साथ ग्रेडिएंट जैल को विकृत करते हैं। एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर और पीएनगासे एफ पर 0.01 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर पर रोडोप्सिन का 200 माइक्रोलीटर मिश्रण तैयार करें। रात भर बर्फ पर अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर और एंडो एफ 1-13 पर 0.01 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर पर रोडोप्सिन का 200 माइक्रोलीटर मिश्रण तैयार करें। रात भर बर्फ पर अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें। एसडीएस-पेज और कूमासी ब्लू स्टेनिंग द्वारा पाचन परिणाम का विश्लेषण करें।
इस अध्ययन में, लघु शुद्धिकरण सेटअप आगे के विश्लेषण के लिए पर्याप्त प्रोटीन मिले । रोडोप्सिन का पराबैंगनी दृश्य स्पेक्ट्रा नीले घटता में अंधेरे राज्य 9-सीआईएस रेटिना बाउंड रोडोप्सिन दिखाता है। रोशनी के बाद, 9-सीआईएस रेटिना को सभी ट्रांस-रेटिना में डिप्रोटीन और आइसोमेरिज़ किया जाता है।
शोषकों पर 280 नैनोमीटर पर शोषकों के अनुपात 488 नैनोमीटर और शोषकों पर 280 नैनोमीटर पर 380 नैनोमीटर पर प्रत्येक डिटर्जेंट में शुद्ध रोडोप्सिन की स्थिरता को दर्शाया गया है। 10 विभिन्न डिटर्जेंट में शुद्ध रोडोप्सिन और रोडोप्सिन-मिनी-गो कॉम्प्लेक्स के आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी प्रोफाइल यहां दिखाए गए हैं । मानक मार्कर प्रोटीन की प्रोफाइल को डीडीएम नमूने के साथ ओवरले के रूप में दिखाया गया है।
पीक प्रोफाइल की व्याख्या डीएमएनजी के लिए डीडीएम, डीएम, साइमल-6, साइमल-5 और ओजीएन के लिए देखे गए आदर्श परिदृश्य के साथ दिखाई गई है। OGNG नमूने के बढ़ाया प्रोफ़ाइल दोनों रोडोप्सिन और रोडोप्सिन-मिनी-जाओ परिसर एक ही प्रतिधारण मात्रा के आसपास नहीं मिल पाई से पता चलता है । रोडोप्सिन-मिनी-गो कॉम्प्लेक्स के रोडोप्सिन और एसईसी शुद्ध नमूनों का एसडीएस-पेज विश्लेषण यहां दिखाया गया है।
यह आंकड़ा एंडो एफ 1 और पीएनगास एफ एंजाइमों के साथ रोडोप्सिन डिग्लिकोसिलेशन के एसडीएस-पेज विश्लेषण को दिखाता है। डिटर्जेंट स्क्रीनिंग को व्यवस्थित तरीके से करना महत्वपूर्ण है, ताकि प्रत्येक व्यक्ति डिटर्जेंट के प्रभाव की अस्पष्टता के बिना स्पष्ट रूप से तुलना की जा सके। विभिन्न मात्रा के प्रोटीन के लिए, थर्मल शिफ्ट परख का उपयोग प्रोटीन स्थिरता पर डिटर्जेंट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है।
इस विधि के लिए धन्यवाद, हम स्थिर प्रोटीन परिसर तैयार करने और अंततः भू-असेंबली में खो गई क्रिस्टल संरचना को हल करने में सक्षम हैं। यह GPCR-जी प्रोटीन बातचीत विशिष्टता में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है ।
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