出生後(P1-3)マウス神経起源ニッチからの神経球の分離と拡大

神経球アッセイは、生理学的および病理学的文脈の両方において増殖、自己再生および多能性を含む神経幹/前駆細胞の固有の特性を研究するためのインビトロ技術で有用である。三次元構造のため、この技術は成人の神経新生を研究するための強力なツールです。また、神経幹細胞/前駆細胞のより高い収率を培養し、得るのにも有用である。

この神経球アッセイは、アルツハイマー病やパーキンソン病や多発性硬化症などの脳障害の研究に適用することができます。神経球はまた、脂肪組織または腸などの他の脳領域またはシステムから得ることができる。フィリパ・リベイロとの手順をデモンストレーションすることは、私のグループの博士課程の学生、リタ・ソアレスです。

出生後1日目から3頭のマウス脳を収穫するには、体の腹側部分を頭の基部に保持し、小さな尖ったはさみを使用して、頭の全長にわたって皮膚に正中線切開を行い、頭蓋骨を露出させる。頭蓋骨の基部に縦切開を行い、脳構造を損傷しないように、できるだけ浅い角度で矢状縫合糸に沿って切断し続けます。湾曲した鉗子を使用して頭蓋骨を側面に剥がし、脳を露出させ、脳の下に小さなへらをスライドさせて脳の基部に接続されている頭蓋神経と血管を切断します。

抗生物質を補った冷たいHBSSのペトリ皿に脳を入れ、低倍率で解剖顕微鏡の下に皿を置きます。脳を後ろ面に配置します。小脳によって脳を保持しながら、 脳の腹側と嗅球から髄を除去するために細かい鉗子を使用します。

脳を腹側の側面に回転させ、残りの髄を剥がします。その後、鉗子を使用して小脳を取り除き、湾曲した尖った鉗子を使用して、組織チョッパーの上に11マイクロメートルの細孔を持つフィルターペーパーの一部に脳を移します。SVZおよびDGマイクロディセクショニングの場合、脳を450マイクロメートルのコロナセクションに切り刻む。

濡れた薄層を使用して、切断顕微鏡の下で冷たい抗生物質補充HBSSで満たされた新しいペトリ皿に切片した脳を収集し、側心室でスライスが到達するまで前部から後部の方法でコロナスライスを分離するために鉗子を使用します。細かい鉗子を使用して、側孔の側壁を囲む組織の薄い層を切断し、線条体の花脈腫と脳梁を除き、鉗子の先端を体頭梁のすぐ下に置き、もう一方の先端を側側心室の腹側領域に隣接する組織に配置してSVZを分離する。側面心室を囲む組織の小さなラインをカットし、補足されたHBSS溶液を含むサンプルチューブに解剖組織を収集します。

すべてのスライスが鉗子でマイクロセクションされ、海馬の形成に達したら、DGがまだ認識できない海馬で最初のスライスを捨てる。DG を除去するには、まず海馬をスライスから分離し、顕微鏡を再び焦点を合わせ、DG の周囲の境界を視覚化します。DG を収穫するには、鉗子を使用して DG と CA1 領域の間を切り取り、続いて DG と CA3 領域の間で垂直に切り取ります。次に、その抗組織と隣接する組織を取り除き、収穫した組織を抗生物質補充HBSS溶液の別々のチューブに入れる。

SVZおよびDGサンプルを解離するには、トリプシン-EDTA 0.05%をHBSS中のトリプシン-EDTA0.05%の5〜10%の最終濃度に加え、摂氏37度で約50分間インキュベーションします。トリプシンの全体の使用またはあまりにも長いインキュベーション時間は、細胞死の増加につながることができます, 負の細胞の成長に影響を与えます.組織が一緒に凝集したら、4回連続の洗浄のための酵素溶液を、洗浄ごとに新鮮な補充されたHBSSの1ミリリットルに置き換えます。

最後の洗浄後、消化した組織を1ミリリットルの無血清培地で再中断し、1ミリリットル当たり10ナノグラムの表皮成長因子と、1本の塩基性線維芽細胞成長因子当たり5ナノグラムを補う。次に、均質な細胞溶液が得られるまでP1000ピペットで7~10回穏やかなピペットで組織を機械的に解化します。解別されたDGまたはSVG細胞の密度を決定するには、各懸濁液中の細胞を造液計で数える。

細胞を神経球に拡大するには、成長因子を補った無血清培地中の1ミリリットル当たり10~4番目の細胞で個々の細胞集団を希釈し、細胞懸濁液の5ミリリットルを未コーティングの直径60ミリメートルのペトリ皿に播種する。その後、SVZ細胞を6〜8日間インキュベートし、DG細胞を摂氏37度で10〜12日間培養し、一次神経球形成を行います。神経球の大部分が直径150~200マイクロメートルの場合、培養物から細胞懸濁液を収穫し、遠心分離によって神経球を採取する。

別の遠心分離で細胞を収集する前に、メーカーの指示に従ってマウスの化学的解離キットで神経球パレットを再中断します。上清を成長因子で補った無血清培地1ミリリットルに置き換え、ペレットを約10回穏やかに評価してみてください。解離した神経細胞を数え、新しい60ミリリットルのペトリ皿に成長因子を補った無血清培地で、ミリリットル密度あたり2倍の10〜4番目の細胞で細胞を再播種します。

次に、細胞を細胞培養インキュベーターに、必要に応じて6〜8日または10〜12日間戻し、二次神経球を得る。神経球アッセイを用いて得られたSVGおよびDG神経球は、未分化Sox2陽性、ネスチン陽性細胞から構成される。特に、SVG由来の神経球は、DGの対応よりも大きな寸法を有する。

重要なのは、分化条件下で、SVGおよびDG由来の神経幹/前駆細胞が神経球から移動し、細胞の擬似単層を形成する。両方の神経性領域において、自己再生を示す対称的な分裂に対応するSox2二重陽性、二重陽性、ダブルコルチン二重陰性細胞対の存在を観察することができる。細胞ペアは、Sox2陽性、ネチン陽性、およびダブルコルチン陰性、および他の細胞Sox2陰性、ネチン陰性、およびダブルコルチン陽性が非対称分裂を示す。

Sox2ダブルネガティブ、ネスチンダブルネガティブ、およびダブルコルチン二重正細胞対は、分化を示す対称的な分裂に対応する。全体として、受死はインビトロで2日目の細胞死亡率を変化させる。Neurito遺伝子導入は、分化の開始時にSVGおよびDG神経幹/前駆細胞の分化から得られたニューロンで評価することができる。

観察されたように、神経突起の長さと影響は分化とともに増加する。増殖細胞の割合が高いのはDGと比較してSVGで観察される。成熟したニューロンに分化増殖前駆物質の割合は、両方の神経原性ニッチで類似しているが.両細胞タイプとも、未熟なニューロン、成熟中性子、オリゴデンドロサイト前駆細胞、成熟したオリゴデンドロサイト、およびアストロサイトに分化することができる。

神経球を得た後、免疫細胞化学、カルシウムイメージング、ウェスタンブロット、RT-PCRを含むいくつかの方法を行い、神経幹細胞/前駆細胞の茎と多能性を研究することができます。神経圏アッセイは、神経幹/前駆細胞の増殖と分化の両方に関与する分子および細胞プロセスをさらに評価するために、遺伝的および疾患モデルに適用することができる。