Immunology and Infection
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क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिस में फ्लोक्सेड कैसेट एलीलिक एक्सचेंज मुटाजेनेसिस द्वारा मार्करलेस जीन विलोपन
Chapters
Summary January 30th, 2020
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यहां वर्णित फ्लोर्सेड कैसेट एलीलिक एक्सचेंज म्यूटाजेनेसिस, फ्लेम का उपयोग करके क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिस में लक्षित, मार्करलेस जीन विलोपन के लिए एक विधि है।
Transcript
फ्लिक्स्ड कैसेट एलेलिक एक्सचेंज म्यूटेनेसिस एक महत्वपूर्ण तरीका है क्योंकि जीन विलोपन एक मूल्यवान उपकरण है जिसका उपयोग जीन उत्पादों के कार्य को समझने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह डाउनस्ट्रीम जीन पर ध्रुवीय प्रभाव पहुंचाए बिना लक्षित जीन हटाने की अनुमति देता है। लगभग तीन किलोबेस क्षेत्रों की पहचान सीधे ऊपर और जीन के नीचे के ऊपर पांच प्रधानमंत्री और तीन प्रधानमंत्री होमोलॉजी हथियार के रूप में सेवा करने के लिए अनुरूप पुनर्संयोजन के लिए और प्राइमर्स आवंटित के रूप में पाठ प्रोटोकॉल में संकेत दिया ।
बाद में डीएनए असेंबली के लिए पर्याप्त टुकड़ा उपज करने के लिए एक या दो प्रतिक्रियाओं में पीसीआर द्वारा हौसले से निकाले गए क्लैमिडियल जीनोमिक डीएनए से तीन किलोबेस पांच प्राइम और तीन प्राइम होमोलॉजी हथियारों को बढ़ाना । पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित पीसीआर टुकड़ों को शुद्ध और केंद्रित करने के बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सेल वन की एक इकाई और एसबीएफ वन की एक इकाई के साथ 20 माइक्रोलीटर प्रतिक्रिया में 20 माइक्रोलीटर प्रतिक्रिया में 500 नैनोग्राम PSUmC-4.0 वेक्टर को पचाएं। पचा और शुद्ध pSUmC-4.0 वेक्टर और दोनों पांच प्रधानमंत्री और तीन प्रधानमंत्री होमोलॉजी हाथ पीसीआर उत्पादों को एक साथ 0.01 पिकोमोल्स वेक्टर के अनुपात में प्रत्येक होमोलॉजी आर्म के 0.09 पिकोमोल्स के अनुपात में मिलाएं।
निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार डीएनए असेंबली प्रतिक्रिया में टुकड़ों को इकट्ठा करें। डीएनए असेंबली रिएक्शन के एक माइक्रोलीटर के साथ इलेक्ट्रोकंप्यूटेंट ई. कोलाई के 50 माइक्रोलीटर को बदलें। प्लेट एलबी एगर प्लेटों पर बदल ई. कोलाई जिसमें 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर स्पेक्टिनोमाइसिन होता है।
रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें। अगले दिन, एक एपिफ्लोरेसेंस उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके हरे और लाल फ्लोरेसेंस के लिए स्क्रीन कॉलोनियां। प्रति आगार प्लेट कुल पांच से 30 कॉलोनियां आने की उम्मीद है।
चयनित उपनिवेशों में से एक रात तरल संस्कृति इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक प्रविष्टि को बढ़ाने के लिए पीसीआर स्क्रीनिंग प्राइमर का उपयोग करके वेक्टर में प्रत्येक होमोलॉजी आर्म के सम्मिलन की पुष्टि करें। बीज McCoy कोशिकाओं जो माउस फाइब्रोब्लास्ट आम तौर पर दो छह अच्छी तरह से प्लेटों में क्लैमाइडिया की खेती के लिए इस्तेमाल के रूप में पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित हैं । एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में, सी ट्रेकोमैटिस जंगली प्रकार सेरोवर L2 प्राथमिक निकायों, या EBs, एक मात्रा है कि दो के एक एमओआई पर एक छह अच्छी तरह से थाली के 12 कुओं को संक्रमित करने के लिए पर्याप्त है पर जोड़ें ।
30 मिनट के लिए 20, 000 बार जी से अधिक पर ईबी गोली और सुपरनैंट त्यागें। कैल्शियम क्लोराइड बफर के 600 माइक्रोलीटर में ईबी को धीरे-धीरे पुनर्व्यवसित करके क्लैमिडियल परिवर्तन शुरू करें। फिर, ट्यूब में 12 माइक्रोग्राम PSUmC-4.0 प्लस होमोलॉजी हथियार जोड़ें और धीरे-धीरे फ्लिकिंग करके समाधान को मिलाएं।
हर 10 मिनट में मिश्रण करने के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें। एचबीएसएस के 24 मिलीलीटर में परिवर्तन समाधान जोड़ें और धीरे-धीरे पाइपिंग करके मिलाएं। छह अच्छी तरह से प्लेटों में ढुलमुल McCoy कोशिकाओं के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए इनोकुलम के दो मिलीलीटर स्थानांतरित करें ।
20 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए 900 बार जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा संक्रमित। इनोकुलम निकालें और अच्छी तरह से RPMI विकास मीडिया नंबर दो प्रति दो मिलीलीटर के साथ बदलें । 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
न्यूनतम सात घंटे के बाद, लेकिन 12 घंटे से अधिक नहीं, चयन मीडिया नंबर एक के अच्छे रूप में दो मिलीलीटर के साथ मीडिया की जगह । संक्रमण के समय से 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन जारी रखें। फसल और एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करके मैककॉय कोशिकाओं के एक ताजा मोनोलेयर पर बैक्टीरिया मार्ग धीरे McCoy मोनोलेयर को परिमार्जन करने के लिए मीडिया में कोशिकाओं को उठा ।
प्रत्येक कुएं से सामग्री को दो मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज में 20, 000 गुना से अधिक ग्राम पर सेल सामग्री गोली । सुपरनेट को त्यागने के बाद, धीरे-धीरे पाइपिंग करके एचबीबीएस के एक मिलीलीटर में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।
चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए २०० बार जी पर सेल मलबे गोली । सुपरनेट को कॉन्फ्लूंट मैककॉय कोशिकाओं के एक ताजा कुएं में स्थानांतरित करें। अच्छी तरह से दो मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से एचबीबीएस का एक अतिरिक्त एक मिलीलीटर जोड़ें।
20 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए 900 बार जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा संक्रमित। संक्रमण के तुरंत बाद चयन मीडिया नंबर एक के साथ इनोकुलम की जगह। हर 48 घंटे में मैककॉय कोशिकाओं के एक ताजा मोनोलेयर पर बैक्टीरिया को पास करना जारी रखें जब तक कि संक्रमण के बाद 24 घंटे एक एपिफ्लोरेसेंस इनफ्लोस्कोप का उपयोग करके लाल और हरे समावेशन का पता नहीं चल जाता है।
एक बार लाल और हरे समावेशन का पता चला है, चयन मीडिया नंबर दो का उपयोग करने से पहले के रूप में मोनोलेयर पासिंग जारी है । मोनोलेयर को तब तक पास करना जारी रखें जब तक कि ग्रीन-केवल समावेशन का पता नहीं चल जाता है 24 घंटे बाद संक्रमण जो पीएसयूएमसी-4.0 वेक्टर के नुकसान और जीनोम में लोक्सपी चयन कैसेट के समावेश को इंगित करता है। फसल और एसपीजी में हरे रंग की केवल समावेशन फ्रीज ।
0.5 और 1.0 के बीच के एक एमओआई के लिए हरे रंग के केवल समावेशन को समृद्ध करें और पाठ में वर्णित एसपीजी में मोनोलेयर्स को फसल दें। 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में 50 माइक्रोलीटर के एलिकोट प्राप्त करें और शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित McCoy कोशिकाओं के साथ एक ३८४ अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट बीज ।
एचबीएसएस में हरे-केवल बैक्टीरिया के एक एलिकोट को पतला करने के लिए लगभग 50 ईबी प्रति 20 मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए। पतला इनोकुलम को जलाशय ट्रे में स्थानांतरित करें। एक बेकार कंटेनर में पूरी थाली उल्टा उल्टा flicking द्वारा ३८४-अच्छी तरह से McCoy कोशिकाओं की थाली से मीडिया को हटा दें ।
मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं में सी ट्रेकोमैटिस इनोकुलम के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। 20 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए 900 बार जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा संक्रमित। फ्लिकिंग द्वारा इनोकुलम निकालें और विकास मीडिया नंबर दो के प्रति अच्छी तरह से 50 माइक्रोलीटर के साथ बदलें।
5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें। पांच से 12 दिनों के लिए थाली इनक्यूबेटिंग के बाद, एक epifluorescence उल्टे माइक्रोस्कोप या एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग मंच का उपयोग कर हरे फ्लोरोसेंट समावेशन के साथ व्यक्तिगत कुओं की पहचान करें । एक P10 टिप के साथ मोनोलेयर खुरचन द्वारा हरे रंग के केवल समावेशन के साथ फसल कुओं ।
कुएं की पूरी सामग्री को एक ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें दो मिलीलीटर एचबीएसएस हैं। धीरे-धीरे मिलाएं और संक्रमण के लिए छह-अच्छी प्लेट में एक ताजा कॉन्फ्लोटर मैककॉय मोनोलेयर के लिए इनोकुलम के दो मिलीलीटर लागू करें। समृद्ध, फ्रीज, और टाइटर क्लोनल आबादी।
मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग करके क्लोनली अलग सी ट्रेकोमैटिस से लक्षित जीन को हटाने की पुष्टि करें। क्लोनली अलग सी ट्रेकोमैटिस FRAEM उत्परिवर्ती, पीएसयू-क्रे वेक्टर, और चयन मीडिया नंबर तीन का उपयोग कर परिवर्तन प्रक्रिया दोहराएं। लाल-केवल समावेशन का पता चलने तक मोनोलेयर को मार्ग करना जो चयन कैसेट के नुकसान को इंगित करता है।
क्लोनली पहले की तरह एक ३८४-अच्छी तरह से थाली में कमजोर पड़ने को सीमित करके लाल केवल समावेशन अलग । 0.1 के एक एमओआई तक पासिंग द्वारा क्लोनल आबादी को समृद्ध करें। एक बार समृद्ध होने के बाद, पीएसयू-क्रे वेक्टर के नुकसान को शुरू करने के लिए चयन मीडिया को विकास मीडिया नंबर दो के साथ बदलें।
क्लोनली पहले की तरह गैर-फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया को अलग करें। हालांकि, समावेशन का पता लगाने के लिए एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के साथ प्लेट को मैन्युअल रूप से स्कैन करें। बैक्टीरिया को समृद्ध और फ्रीज करें।
मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर, पश्चिमी ब्लॉटिंग, और पूरे जीनोम डीएनए अनुक्रमण का उपयोग कर उत्परिवर्ती तनाव के लिए स्क्रीन के रूप में पहले वर्णित है । प्रतिनिधि डेटा दिखाया गया है जिसमें tmeA जीन हटाने के लिए लक्षित है । सी ट्रेकोमैटिस tmea हटाने तनाव FRAEM का उपयोग कर उत्पन्न होता है और सी. ट्रेकोमैटिस tmeA-lx तनाव FLAEM का उपयोग कर उत्पन्न होता है।
TmeA और डाउनस्ट्रीम tmeB के सापेक्ष डीएनए कॉपी नंबर, pSUmC-४.० चयन कैसेट पर निहित gfp, और क्रे पीएसयू-क्रे वेक्टर पर निहित सभी दिखाए गए हैं । दोनों उत्परिवर्ती उपभेदों में टीएमईए लोकस का विलोपन होता है। हालांकि, टीएमईए-एलएक्स में चयन कैसेट शामिल नहीं है जैसा कि जीएफपी डीएनए की अनुपस्थिति से संकेत मिलता है।
टीएमएनए उत्परिवर्ती तनाव ने एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर के अनुसार टीएमबी की अभिव्यक्ति में कमी की है। जब FLAEM का उपयोग टीएमईए-एलएक्स उत्परिवर्ती तनाव उत्पन्न करने के लिए किया जाता है, तो एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर से पता लगाया जाता है कि टीएमईबी की अभिव्यक्ति बहाल की जाती है। जीन के लक्षित विलोपन के लिए होमोलॉजी हथियारों के साथ पीएसयूएमसी वेक्टर का सावधानीपूर्वक निर्माण आवश्यक है।
क्लैमिडियल परिवर्तन से पहले सटीक वेक्टर असेंबली सुनिश्चित करने के लिए समय लिया जाना चाहिए। FLAEM शोधकर्ताओं को विशिष्ट जीन का अध्ययन करने और लक्ष्य जीन जो अध्ययन चकित हो सकता है की अभिव्यक्ति में कमी के बिना लक्षित विलोपन बनाने के लिए एक उपकरण प्रदान की गई है । FLAEM द्वारा उत्पन्न C.trachomatis हटाने म्यूटेंट विकास और रोगजनक तंत्र सहित क्लैमिडियल जीव विज्ञान के पहलुओं की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
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