Login processing...

JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Neuroscience

Laserindusert hjerneskade i motorcortex av rotter

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

Journal (Neuroscience)

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

Journal (Neuroscience)

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

Click here for the English version

Laserindusert hjerneskade i motorcortex av rotter

Article DOI: 10.3791/60928-v

September 26th, 2020 •

Ruslan Kuts*¹, Israel Melamed*², Honore N. Shiyntum³, Benjamin F. Gruenbaum⁴, Dmitry Frank¹, Boris Knyazer⁵, Dmitry Natanel¹, Olena Severynovska³, Max Vinokur¹, Matthew Boyko¹

¹Division of Anesthesiology and Critical Care, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, ²Department of Neurosurgery, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, ³Department of Biochemistry and Physiology, Faculty of Biology, Ecology, and Medicine, Oles Honchar Dnipro National University, ⁴Department of Anesthesiology, Yale University School of Medicine, ⁵Department of Ophthalmology, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

September 26th, 2020

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Protokollen som presenteres her viser en teknikk for å skape en gnagermodell av hjerneskade. Metoden som er beskrevet her bruker laserbestråling og retter seg mot motorcortex.

Transcript

Vår protokoll gir en ny metodikk for å skape traumatisk hjerneskade hos rotter ved hjelp av laserbestråling for å skape en fokuspåvirkning i motorcortex. Den største fordelen med denne teknikken er den lave variasjonen i infarktområdet, de lave dødelighetene og den relative enkelheten i prosedyren som ikke krever ekspertbehandlere. Å demonstrere prosedyren vil være Dmitry Natanel, en forsker fra laboratoriet vårt.

For å utføre en laserindusert hjerneskade, først tildele 20, 300 til 350 gram Sprague Dawley rotter inn i lasergruppen og 20 til kontroll Sham-opererte gruppen. Etter å ha bekreftet mangel på respons på abstinensrefleks, legg en rotte på en rektal temperatur regulert varmepute og bruk en barbermaskin for å fjerne nok hår fra skadestedet med en omtrent to centimeter hårfri margin rundt snittet. Desinfiser den eksponerte huden med 70% etanol og plasser rotten i utsatt stilling i en stereotaksisk hodeholder.

Lag et tre centimeter snitt for å tillate lateral refleksjon av hodebunnen for å avsløre området mellom bregma og lambda. Holder en Nd: YAG laser med topp bølgelengde på 1064 nanometer i en to millimeter avstand fra skallen, administrere 50 joule ganger 10 poeng med en ett sekund puls varighet til det eksponerte området av skallen over høyre halvkule. Etter at laserskaden er levert, fjern rotten fra enheten og lukk hodebunnen med 3-0 silkekirurgiske suturer.

Deretter plasserer du rotten i buret med overvåking til full recumbency. 24 timer etter prosedyren, bruk et 43-punkts poengsystem for å evaluere den nevrologiske alvorlighetsgraden. Testing av dyrene for nevrologiske underskudd, atferdsforstyrrelser, strålebalanseringsoppgave og reflekser, og tildele høyere score for mer alvorlige funksjonshemninger.

Etter vurderingen høster hjernen fra hvert eksperimentelt og kontrollerer dyr i henhold til standardprotokoller. For å vurdere hjernens infarktvolum, seksjoner de høstede hjernene i seks to millimeter tykke koronale skiver og inkubere hver skive i 0,05% TTC i 30 minutter ved 37 grader Celsius. Etter farging skanner du disse skivene med en optisk skanner med en oppløsning på 1600 med 1600 punkter per tomme.

De uopphetede områdene i de faste hjerneskivene defineres som infarcted. For å evaluere forekomsten av blod hjernebarrierebrudd, 24 timer etter laserindusert skade belastning en sprøyte med 2% Evans blå fargestoff fortynnet i fire milliliter per kilo saltvannsløsning og levere løsningen intravenøst til de skadde og kontrollere rotter via den hernulerte halevenen. La løsningen sirkulere i en time før du bruker kirurgiske pinsett og saks for å åpne brystet til det første dyret.

Perfuse det eksponerte hjertet med avkjølt 0,9% saltvann via venstre ventrikkel ved 110 millimeter kvikksølv av trykk til en fargeløs profusionvæske observeres fra høyre atrium. Deretter høster hjernen og får to millimeter rostral caudal skiver. Skill de venstre hjerneskivene fra de riktige hjerneskivene for å tillate evaluering av de skadede og ikke-skadde halvkulene separat, og veie prøvene.

Homogeniser prøvene ved hjelp av en mørtel og pestle og inkuber vevsprøvene i 50% trikloreddiksyre i 24 timer. Neste dag sentrifuger de homogeniserte hjernevevsprøvene i 20 minutter ved 10 000 ganger G og romtemperatur, og bland en milliliter av supernatanten med 1,5 milliliter på 96% etanol ved ett til tre forhold. Deretter bruker du en fluorescensdetektor ved en 620 nanometer eksitasjon og 680 nanometer utslippsbølgelengde for å vurdere blodhjernebarrierebrudd.

Som observert av histologisk analyse, Evans blå farging kan brukes til å avsløre forekomsten av hjerneskade på laser og MCAO modell dyr. I denne representative analysen ble det ikke registrert dødsfall eller subaraknoid blødninger i enten kontroll- eller eksperimentelle grupper, og MCAO-gruppen hadde en 20 % rate av både dødelighet og subaraknoid blødning. De relative kroppstemperaturendringene i rotter fra begge gruppene var også like, til tross for en forskjell i variasjonen til begge gruppene.

De nevrologiske alvorlighetsgradene var betydelig verre i både laser- og MCAO-modellene sammenlignet med den Sham-opererte kontrollgruppen. Laserindusert til hjerneskade forårsaket også en betydelig økning i infarktvolum på målhalvkule sammenlignet med den Sham-opererte kontrollgruppen. Imidlertid var det infarktvolumet av lasermodellen mindre sammenlignet med dyrene skadet av MCAO-teknikken.

Ingen forskjell i hjerneødem ble observert mellom den laserinduserte hjerneskademodellen og den Sham-opererte kontrollgruppen. Det var imidlertid en betydelig forskjell i hjerneødem mellom lasermodellen og MCAO skadede grupper. Sammenlignet med den Sham-opererte kontrollgruppen forårsaket de laserinduserte hjerneskade- og MCAO-teknikkene en betydelig økning i blodhjernebarrierebrudd på de ikke-skadde og målrettede halvkulene.

Mens du prøver denne modellen, husk å nøyaktig målrette motorcortex området og å standardisere energien, antall poeng blir bestrålt, og den totale utstillingstid. Etter denne prosedyren kan en bred mengde atferdstester, for eksempel strålevandring, Froedert og andre evalueringer utføres.

X

Simple Hit Counter