Biology
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कीड़ों में क्रिटिकल थर्मल लिमिट्स के उच्च थ्रूपुट परख
Summary June 15th, 2020
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थर्मल सीमा वातावरण जीवों बर्दाश्त है, जो तेजी से जलवायु परिवर्तन के चेहरे में मूल्यवान जानकारी है भविष्यवाणी कर सकते हैं । यहां वर्णित कीड़ों में महत्वपूर्ण थर्मल मिनीमा और गर्मी नॉकडाउन समय का आकलन करने के लिए उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल हैं। दोनों प्रोटोकॉल थ्रूपुट को अधिकतम करते हैं और परख की लागत को कम करते हैं।
Transcript
थर्मल सहिष्णुता प्रजातियों के वितरण और जलवायु परिवर्तन के लिए प्रतिक्रियाओं का एक महत्वपूर्ण घटक है । यहां हम छोटी कीड़ों में गर्मी और ठंडी सहिष्णुता का तेजी से आकलन करने के तरीके प्रदान करते हैं। ठंड सहनशीलता को मापने के लिए ये तरीके, महत्वपूर्ण थर्मल न्यूनतम और गर्मी सहिष्णुता के माध्यम से, गर्मी के माध्यम से समय नीचे खटखटाया उच्च थ्रूपुट, अर्ध स्वचालित और न्यूनतम उपकरणों की आवश्यकता होती है।
प्रक्रिया का प्रदर्शन डेविड Awde, मेरी प्रयोगशाला से एक postdoc होगा । एक महत्वपूर्ण थर्मल न्यूनतम परख स्थापित करने के लिए, एक तापमान नियंत्रित तरल पदार्थ स्नान पर बिजली और एक कार्यक्रम चलाने के लिए खेलने के बटन दबाएं, स्थापना और 25 डिग्री सेल्सियस के लिए स्नान के तापमान को बनाए रखने । 5.08 सेंटीमीटर व्यास फिल्टर के साथ कॉलम के शीर्ष पर प्लग को बदलने से पहले, तरल बाथरूम कॉलम को 25 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने की अनुमति देने के लिए पांच से 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
लगभग 40 मक्खियों को उनके भोजन की शीशी से कीप के माध्यम से कॉलम में टैप करें और जल्दी से प्लग के साथ कीप को बदल दें, इस बात का ध्यान रखें कि किसी भी मक्खियों को भागने न दें। फिर मक्खियों को व्यवस्थित करने की अनुमति दें। मक्खियों को चढ़ने के लिए प्रोत्साहित करने के लिए कभी-कभी नीचे प्लग का दोहन करना।
पांच मिनट के बाद, महत्वपूर्ण थर्मल मिनीमा रैंपिंग कार्यक्रम शुरू करने के लिए, तरल पदार्थ स्नान लाभ पर स्टार्ट बटन दबाएं। कंप्यूटर पर थर्मल कपल रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर खोलने के लिए क्लिक करें और कॉलम के अंदर तापमान रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए रिकॉर्ड पर क्लिक करें, परख की अवधि के लिए हर सेकंड । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक तापमान रिकॉर्डिंग में दूसरे के लिए विशिष्ट टाइमस्टैंप शामिल है, ताकि तापमान डेटा को बाद में ड्रोसोफिला फ़नल मॉनिटर से डेटा के साथ मर्ज किया जा सके।
एक 15 मिलीलीटर शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब में 90% इथेनॉल के पांच मिलीलीटर जोड़ें और कॉलम के नीचे एक रैक में ट्यूब रखें। कभी-कभी नीचे चढ़ने के लिए नीचे की ओर किसी भी मक्खियों को लुभाने के लिए कॉलम के नीचे प्लग पर टैप करें। अधिकांश मक्खियां एक पर्च पर या कॉलम के शीर्ष के पास 15 डिग्री सेल्सियस तक होंगी।
15 डिग्री सेल्सियस पर, ड्रोसोफिला कीप मॉनिटर में 75 मिलीमीटर बाहरी व्यास ग्लास कीप रखें। नीचे प्लग निकालें और इथेनॉल में प्लग पर अभी भी किसी भी मक्खियों को इकट्ठा करें। रिटॉर्ट रिंग, कीप मॉनिटर और कीप को एडजस्ट करें, ताकि वे कॉलम के नीचे हों।
सुनिश्चित करें कि कीप का होंठ पूरी तरह से कॉलम के नीचे को सील करता है और 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में फ़नल के नीचे डालता है। ड्रोसोफिला कीप मॉनिटर सॉफ्टवेयर खोलें। सॉफ्टवेयर तुरंत उस समय और तारीख को रिकॉर्ड करना शुरू कर देगा जिस पर मक्खियां अपने महत्वपूर्ण थर्मल मिनिमा तक पहुंचती हैं।
मक्खियों जो अपने महत्वपूर्ण थर्मल मिनीमा तक पहुंचते हैं, ड्रोसोफिला कीप मॉनिटर के माध्यम से अपने न्यूरोमस्कुलर फ़ंक्शन और उनके पर्चों से गिर जाएंगे। यह निगरानी करने के लिए कि क्या सभी मक्खियां अपने महत्वपूर्ण थर्मल मिनिमा तक पहुंच गई हैं, क्योंकि तापमान कम हो जाता है, यह देखने के लिए शीर्ष प्लग और पर्चों की जांच करें कि क्या कोई मक्खियां अभी भी बैठे हैं। जब सभी मक्खियों, अपने महत्वपूर्ण थर्मल मिनीमा तक पहुंच गए हैं, तो ड्रोसोफिला कीप मॉनिटर को स्थानांतरित करें और कॉलम खोलने से दूर कीप करें।
दुर्लभ अवसरों पर, मक्खियां अपने महत्वपूर्ण थर्मल मिनीमा तक पहुंच सकती हैं, लेकिन कॉलम में फंसी रहती हैं। इन मक्खियों को हटाने के लिए शीर्ष प्लग खोलें। परख नीचे गिरा एक उच्च थ्रूपुट गर्मी स्थापित करने के लिए, एक एस्पिरेटर और पट ढक्कन का उपयोग करें, व्यक्तिगत कार्बन डाइऑक्साइड बेहोश मक्खियों लोड करने के लिए, एक संशोधित ९६ अच्छी तरह से कोई नीचे थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से और एक स्पष्ट तंग फिटिंग ढक्कन के साथ थाली सील ।
फिर प्लेट को भोजन की आपूर्ति पर रखें और मक्खियों को कम से कम 48 घंटे के लिए 96 अच्छी प्लेट को अनुकूलित करने की अनुमति दें। परख के दिन, इनक्यूबेटर को 37.5 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें, 30 मिनट के बाद फ्लाई कल्चर प्लेट को ट्रे के नीचे सफेद कागज के खिलाफ प्लेट के नीचे के साथ इनक्यूबेटर में रखें। ट्रे पर अच्छी तरह से कॉलम और पंक्ति के नामों के अभिविन्यास पर ध्यान दें और वेबकैम के फ्रेम में और अभिविन्यास को सत्यापित करने में मदद करने के लिए प्लेट के किनारों और किनारों के साथ रंगीन टेप रखें।
जब प्लेट स्थिति में हो, तो इनक्यूबेटर दरवाजा बंद करें और वीडियो रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में रिकॉर्ड पर क्लिक करें। दो घंटे के बाद, रिकॉर्डिंग की जांच करने के लिए कि क्या मक्खियों के सभी, अपने अंतिम विश्राम स्थान पर पहुंच गए है और आगे बढ़ बंद कर दिया । जब सभी मक्खियों ने आगे बढ़ना बंद कर दिया है, तो मक्खियों को रोककर निपटाएं।
वीडियो फ़ाइल खोलें और प्रत्येक अच्छी तरह से प्रत्येक फ्लाई के नॉकडाउन समय को रिकॉर्ड करें। गर्मी का सबसे सुसंगत उपाय परीक्षणों और टिप्पणियों के बीच डाउनटाइम नीचे गिरा दिया समय है जिस पर एक मक्खी अपने अंतिम विश्राम स्थान तक पहुंचता है । फिर वीडियो को रिवर्स में ट्रैक करें, एक ही अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित करें और उस समय को ध्यान में रखते हुए जिस पर फ्लाई पहले अपने अंतिम विश्राम स्थल से चलती है।
प्रत्येक मक्खी के अंतिम आराम समय का निर्धारण मुश्किल हो सकता है। एक सटीक विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए, अपना समय लेना और प्रत्येक को व्यक्तिगत रूप से अच्छी तरह से निरीक्षण करना महत्वपूर्ण है। इस प्रतिनिधि विश्लेषण में, ड्रोसोफिला जेनेटिक रेफरेंस पैनल लाइन से महिलाओं ने डीजीआरपी लाइन 714 से महिलाओं की तुलना में थर्मल मिनिमा तापमान काफी कम किया था।
इसके अलावा, गर्मी ३७.५ डिग्री सेल्सियस पर समय नीचे खटखटाया, ७३ और ४६१ DGRP लाइनों से महिलाओं के बीच काफी अलग है । मामूली संशोधनों के साथ, गर्मी को मापने के लिए इस विधि ने समय को नीचे गिरा दिया, अन्य थर्मल सहिष्णुता लक्षणों को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे कि चिल-कोमा रिकवरी समय या महत्वपूर्ण थर्मल अधिकतम। जांचकर्ताओं के लिए हाथ पर समय को काफी कम करके, इन तरीकों ने आनुवंशिक भिन्नता और थर्मल सहिष्णुता लक्षणों की खोज को एक पैमाने पर अनुमति दी है जो पहले संभव नहीं था ।
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