Developmental Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Chapters
Summary June 9th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
伤口诱导的多倍体化是一种保守的组织修复策略，其中细胞在大小上生长，而不是分裂，以弥补细胞损失。下面是一个详细的协议，如何使用果蝇作为模型来测量皮骨及其遗传调控在上皮伤口修复。
Transcript
该协议可用于研究伤口引起的多倍体化。保存组织修复过程，细胞在成年果蝇中生长而不是分裂。一个简单的穿刺伤口可以在短短两天内诱导苍蝇上皮的多倍体。
然后，可以轻松评估上皮细胞大小、倍体和组织。首先收集两个小瓶，含有10至15个新关闭的雌性果蝇的菌株。在新鲜食物小瓶中老化苍蝇，每瓶大约5只雄性苍蝇在25摄氏度，直到三到五天大。
对于腹部受伤，在孵育结束时，使用单个0.1毫米不锈钢销组装多个销架，每个针的尖端起搏。在立体显微镜下，在二氧化碳飞垫上麻醉老年雌性果蝇。用画笔把苍蝇安排成一排。
戴上安全眼镜，一只手戴着针架，另一只手戴着钳子，用钳子将苍蝇的腹腹部朝上放置。然后刺穿目标 A4 两侧的成年雌性苍蝇在心腹中线搅拌之夜的上皮蓝色右侧区域内，将受伤的苍蝇返回食物小瓶，直到受伤的后所需的实验时间点。在实验终点，检查每个麻醉苍蝇在立体显微镜下是否存在伤口和疤痕，用格蕾丝的溶液填充九井玻璃解剖盘的一口井。
使用一对钳子，抓住受伤的雌性苍蝇的后侧胸部和淹没飞在溶液井。用另一只手，使用第二对钳子刺穿并去除目标 A6 以下的背节角质层，在果蝇的后部。如果内部器官未提取，则向腹部的后侧施加压力，以挤出剩余的器官。
使用钳子在目标 A2 上方的胸部交界处捕捉整个腹部，然后将腹部转移到包含大约 100 微升格蕾丝溶液的井中。当所有腹部都收集好时，将格蕾丝在收集井中的溶液体积减小到 30 微升。用一只手的钳子将腹部的侧侧向下，另一只手将威尼斯弹簧剪刀的下刀片插入每个腹部的腹腔，然后沿着后侧中线切割，直到腹部完全打开。
将 Grace 溶液的 30 微升添加到干燥解剖板的每个安装区域中，每个腹部安装区域有 4.1 毫米针脚，并将圆角腹部放入溶液液滴中。当所有腹部都经过圆角和放置时，将腹部固定在四个后角的盘子上。注意组织平躺，不撕裂或过度拉伸腹部组织。
然后，将 Grace 的解决方案替换为每个安装区域的固定解决方案 30 微升。并在每道菜的底部贴上胶带标签，以标记每个对照组和实验组。安装苍蝇组织样本。
染色后，使用钳子在立体显微镜下从解剖板上解开腹部。并使用钳子将每个样品的背侧板转移到单个玻璃盖滑单上约 30 微升安装介质中。在立体显微镜下，使腹部组织定向，使内侧朝下朝盖滑，并使用钳子将定向腹部拉到每个介质液滴的边缘。
将每个安装的盖滑放在标有玻璃幻灯片上。并使用实验室组织去除任何多余的安装介质。然后用透明指甲油密封盖滑的边缘，将幻灯片存放在四摄氏度的幻灯片盒中，直到其成像。
隔膜结蛋白快三，它标记细胞结，提供一个指标，在制备过程中是否发生任何处理扰动。必须丢弃且不包括在分析中，必须丢弃具有未污染区域较大划痕的、扰动伤口区域的腹部。当中央大型多核细胞覆盖伤口疤痕时，伤口修复完成。
上皮纸上大于10微米的间隙被认为是伤口闭合和再上皮化的缺陷。在这个具有代表性的分析中，使用具有抑制性线粒体细胞活化的苍蝇，52%的伤口无法在伤口鳞片上形成连续的上皮片。此膜伤口愈合文章提供了更多信息，以伤口修复缺陷的程度，允许重新上皮缺陷被分组为完全开放，部分关闭或完全关闭。
例如，在此实验中，通过同时阻断内皮复制和细胞融合抑制伤口诱导多倍体化，导致92%的上皮伤口保持完全开放。而细胞细胞周期的激活导致上皮伤口闭合缺陷。此外，通过加入胸腺素模拟EDDU来检测细胞周期活性，通过直接测量核DNA含量确定上皮倍数。
解剖腹部上皮时，注意不要用任何分离工具接触组织，因为这将划伤样品。解剖后，细胞增殖，细胞死亡，细胞损失切口大小或核DNA含量评估可以进行，以更好地了解伤口诱导多倍体化。或上皮内的其他过程。
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
