Kombinierte in vivo anatomische und funktionelle Spurensuche von ventralen Tegmentalflächen-Glutamat-Terminals im Hippocampus

Das vorliegende Protokoll analysiert eine kostengünstige und unkomplizierte Methode zur kombinierten neuroanatomischen und elektrophysiologischen Verfolgung von Neuroschaltkreisen in vivo. Die Technik ermöglicht die Kartierung von Adjunktendigen von einer bestimmten Neuronenpopulation zu einer Zielstelle. Ebenso kann die anatomische Karte für diese Terminals durch optogenetische Stimulation während der extrazellulären Aufzeichnung an der Zielstelle verifiziert werden.

Dieses Protokoll kann zur Untersuchung mehrerer neuronaler Schaltkreise angewendet werden, die mit sensorischen, motorischen und kognitiven Funktionen verbunden sind. Die Durchführung dieses Verfahrens erfordert einige Kenntnisse in der stereotaktischen Chirurgie von Nagetieren und im Umgang mit empfindlichen neuronalen Elektroden. Der Anschluss des Aufnahmesystems, um Rauschen bei Aufnahmen zu vermeiden.

Die visuelle Demonstration zeigt die grundlegenden Schritte beim Aufbau eines erschwinglichen LED-Systems für die In-vivo-Optogenetik. Außerdem wird gezeigt, wie der Verstärker mit dem LED-Treiber für eine synchronisierte Aufnahme und Stimulation in einer anästhesierten Maus verbunden wird. Legen Sie ein Heizkissen so auf den stereotaktischen Rahmen, dass der Körper der Maus darauf liegt, um die Körpertemperatur während des gesamten Eingriffs zu halten, und befestigen Sie dann den Kopf vorsichtig auf dem stereotaktischen Gerät.

Bereiten Sie den Operationsbereich vor, indem Sie ihn zuerst mit Jodlösung und dann mit Alkohol reinigen, um das Jod zu entfernen. Tragen Sie anschließend topisches Lidocain auf, um das Gefühl auf der Kopfhaut zu blockieren. Machen Sie dann mit einem Skalpell einen Schnitt in der Mittellinie, der sich von der Frontal- bis zur Hinterhauptregion erstreckt.

Für die ventrale tegmentale Injektion oder VTA-Injektion positionieren Sie eine ultrafeine Nadelspritze mit stumpfer Spitze in einem Abstand von minus 3,08 Millimetern anterior posterior und 0,5 Millimeter medialer lateraler Koordinaten relativ zum Bregma. Bohren Sie mit einem Bohrwerkzeug ein ein ein Millimeter großes Loch in den Schädel an der markierten Koordinate. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um den Spritzenhalter an einem Mikromanipulator zu befestigen und die Spritze mit doppelt destilliertem Wasser zu füllen, um den Flüssigkeitsfluss zu reinigen und zu testen.

Geben Sie dann das Wasser ab, um den Durchfluss der Spritze zu testen. Tauen Sie Aliquoten des Adeno-assoziierten Virus oder AAV-Cocktails auf Eis auf. Füllen Sie die montierte Spritze mit 1.000 Nanolitern AAV-Lösung und geben Sie 10 Nanoliter der Lösung ab, um den Fluss der Flüssigkeit zu bestätigen.

Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel zur Injektionsstelle abzusenken, und injizieren Sie 600 bis 800 Nanoliter AAV in den VTA, wobei die Lösung mit 60 Nanolitern pro Minute abgegeben wird. Drei Wochen nach der AAV-Injektion befestigen Sie den Kopf des Tieres wie zuvor beschrieben auf einem stereotaktischen Rahmen und führen Sie eine Kraniotomie durch, um die Dura freizulegen. Verwende ein Bohrwerkzeug, um einen Teil des Scheitelknochens zu entfernen.

Verwenden Sie unter einem Präpariermikroskop eine gebogene 27-Gauge-Nadelspitze, um die freiliegende Dura herauszuschneiden, und achten Sie darauf, die empfindliche Schalenhülle und das kortikale Gewebe in diesem Bereich nicht auseinanderzuziehen. Tragen Sie Tropfen mit künstlichem Liquor cerebrospinalis auf den Kraniotomiebereich auf, um Trockenheit zu verhindern. Bohren Sie ein Loch in das Hinterhauptbein, um die Erdungsschraube zu halten und ein Erdungskabel aus Edelstahl anzuschließen.

Bevor Sie die Kanüle absenken, schließen Sie das Glasfaserkabel an eine fasergekoppelte LED-Quelle an. Senken Sie die optische Faser mit einem Durchmesser von 400 Mikrometern bei den Koordinaten AP minus 3,08 Millimeter und ML 0,5 Millimeter in den VTA ab. Positionieren Sie mit einem Mikromanipulator die Elektrodenkontaktstellen in der pyramidalen Zellschicht des CA1.

Um den Lichtimpuls mit der neuronalen Aufzeichnung zu synchronisieren, verbinden Sie den LED-Treiber und den digitalen Import des Aufnahmecontrollers mit einem Transistor-Transistor-Logikimpulsgeber mit einem BNC-Splitter. Stellen Sie den Knopf ein, um die effektive Intensität zu bestimmen, die eine Reaktion erzeugen kann, ohne photoelektrische Artefakte zu erzeugen, und verbinden Sie den Boden auf dem Schädel mit dem Boden auf dem Adapter. Verbinden Sie den Vorverstärker-Kopftisch über ein serielles Peripherie-Schnittstellenkabel mit dem Recording-Controller und überprüfen Sie die LED-Farbleuchten an den Anschlüssen des Recording-Controllers.

Grüne und gelbe LEDs zeigen die richtige Spannung auf der angeschlossenen Verstärkerplatine an, und die rote LED zeigt eine funktionierende Software-Kopftischsteuerung an. Wählen Sie nach dem Start der Software das Dateiformat aus und ändern Sie den Dateinamen. Wechseln Sie auf den Port für den angeschlossenen Kopftisch und klicken Sie auf Alle am Port deaktivieren, wenn die Elektrode weniger Kanäle als der Kopftisch hat.

Wählen Sie die entsprechende Anzahl von Kanälen aus, die auf dem Bildschirm angezeigt werden sollen. Um den TTL-Zeitstempel für die synchronisierte neuronale Aufzeichnung und den durch Lichtimpulse ausgelösten Zeitstempel zu erfassen, klicken Sie auf die digitalen Importe und aktivieren Sie digital in null eins. Dies muss mit dem BNC-Anschluss an den digitalen Importen des Verstärkers übereinstimmen.

Passen Sie die Zeitskala und die Spannungsskala für die entsprechende Wellenformanzeige an und wählen Sie die Abtastrate aus, wobei zu beachten ist, dass eine höhere Abtastrate und Anzahl von Kanälen die Dateigröße erhöht. Stellen Sie als Nächstes die Verstärkerbandbreite für die Aufnahme mit einem Gerät ein. Hier wurde eine Grenzfrequenz von 300 bis 5.000 Hertz verwendet.

Für Spike-Sound klicken Sie auf Analog-Ausgang und aktivieren Sie den analogen Anschluss. Stellen Sie dann die Verstärkung und den Schalldämpfer für einen optimalen Klang ein. Um die Verstärkeraufnahme und die Lichtimpulsfolge zu synchronisieren, klicken Sie auf die Registerkarte "Anzeige" und aktivieren Sie die Anzeigemarkierung.

Wechseln Sie zum entsprechenden Kanal, der der BNC-Verbindung entspricht, und überprüfen Sie die Anschlüsse, um sicherzustellen, dass die Aufzeichnungskanäle und der digitale Eingangskanal für die Erfassung von neuronalen Spitzen und Zeitstempeln von Lichtimpulsen aktiviert sind. Klicken Sie auf Spike-Oszilloskop, um die Wellenformen anzuzeigen, die den kontinuierlich aufgezeichneten Spike-Zug bilden. Legen Sie mit der Maus den Schwellenwert für die anzuzeigenden Wellenformen fest.

Überprüfen Sie dann den RMS, um den Rauschpegel in Ihrer Aufnahme zu bestimmen. Die Adeno-assoziierte Virusexpression wurde durch Immunfluoreszenzbildgebung von EYFP im ventralen tegmentalen Bereich von Mäusen 21 Tage nach der Injektion verifiziert. Die Fluoreszenzbildgebung wurde auch verwendet, um präsynaptische VTA-Glutamatprojektionen in den Hippocampus-Schichten DG, CA3 und CA1 zu detektieren.

Nachdem die extrazelluläre Spannungsaktivität erkannt wurde, wurde die Basisaktivität etwa 10 Minuten lang aufgezeichnet, bevor der Lichtimpuls mit der gewünschten Frequenz ausgelöst wurde. Dies ermöglichte es, die Feuerungs- oder Burst-Raten von CA1-putativen Neuronen vor und nach VTA-Glutamat-Photostimulation zu vergleichen. Um dieses Ergebnis zu unterstützen, ergab ein statistischer Vergleich der Feuerungsraten des CA1-Netzwerks vor und nach der Photostimulation einen signifikanten Anstieg für die Zeit nach der Stimulation.

Die anschließende Analyse des Rastertrains zur Erkennung von Bursts zeigte ebenfalls eine erhöhte Burst-Rate für die CA1-mutmaßlichen Pyramidenneuronen nach Photostimulation. Die Reaktion auf die Photosimulation wurde durch Fluoreszenz der AAV-Reporterexpressionen an den Stimulusstellen identifiziert. Außerdem sollte die Beschreibung von mit dem Ort der Aufzeichnung für responsive putative Einheiten korreliert werden.

Diese Methode kann auch bei wachen Mäusen durchgeführt werden, die Verhaltensaufgaben ausführen. In diesem Fall sollten chronisch implantierbare Sonden und eine faseroptische Kanüle verwendet werden. Diese Technik ermöglicht eine robuste Verfolgung von Neuroschaltkreisen durch eine Kombination aus präsynaptischer Endverteilung an der Zielstelle und Modulation präsynaptischer Terminals, um die Reaktion der Zielstelle in vivo zu detektieren.