Name: Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprenda a monitorar invasão de células cancerígenas e citotoxicidade de células T em cultura 3D usando esferoides em matriz de colágeno tipo I. Este método simplifica fluxos experimentais em imunoterapia oncológica.

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Agradecemos a Virginie Ory, PhD por discussões úteis e conselhos sobre a abordagem do modelo de cocultura 3D. Agradecemos também a Elizabeth Jones pela excelente assistência técnica com a secção IHC. Este estudo foi apoiado por subvenções do DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) para YL (LI 2547/4-1) e dos Institutos Nacionais de Saúde para AW (R01 CA231291), para ATR (R01 CA205632), para GWP (R01 CA218670) e a Bolsa Núcleo do Centro de Câncer (P30 CA51008).

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método aqui apresentado descreve a geração de esferoides tumorais 3D, que permite a co-cultura com células T, ensaios funcionais e moleculares baseados em células, bem como uma variedade de possibilidades de monitoramento e análise usando um único dispositivo. A grande vantagem da nossa abordagem é que ela não requer a transferência da cultura 3D para um ensaio separado e mantém a integridade da cultura 3D ao longo dos ensaios.
O fluxo de trabalho aqui apresentado pode ser modificado conform...

Apesar de melhorias significativas na imunoterapia contra o câncer na última década, nossa compreensão mecanicista da sensibilidade e resistência aos tratamentos ainda é bastante pobre1. Está bem estabelecido que os tumores apresentam heterogeneidade substancial, e que as interações dinâmicas das células tumorais com seu microambiente, bem como com as células imunes, impactam a morte celular tumoral, comportamento invasivo e resposta a tratamentos que incluem imunoterapia1,,2,3. Como um braço do sistema imunológico adaptativo, as células T executam citotoxicidade específica das células. A análise do reconhecimento de células T e a resposta às células cancerosas fornecem insights mecanicistas sobre resistência e sensibilidade aos tratamentos modulatórios imunológicos.
A modelagem in vitro e o monitoramento das interações entre câncer e células T em um ambiente apropriado tem sido desafiador e, até agora, resultou em insights mecanicistas limitados. A maioria dos ensaios baseados em células dependem de um ambiente bidimensional (2D), que carece de características-chave que são fundamentais para recapitular a fisiologia tridimensional (3D) in vivo4,5,6, ou seja, interações células espaciais, contato com a matriz extracelular (ECM)7, demanda metabólica dinâmica, aumento da hipóxia devido ao crescimento de massa8, e efeitos do microambiente tumoral (TME)9. Por outro lado, ainda há uma série de deficiências com os sistemas de cocultura tridimensional (3D) atualmente utilizados (3D): (1) a natureza demorada da geração e colheita esferoides5,,10, (2) a falta de controle sobre o tamanho do esferoide, forma e densidade celular11,12, (3) ensaios do tipo de baixo rendimento, (4) a exigência de equipamento especial13,,14, (5) a necessidade de transferir a cocultura para ambientes distintos para diferentes ensaios15,,16,,17. Em particular, a transferência de um ensaio de co-cultura muitas vezes leva à interrupção dos esferoides e à perda da integridade da co-cultura. Isso se aplica especialmente a esferoides "soltos" com menor adesão celular. Por exemplo, a maioria dos ensaios de invasão 3D exigem que os esferoides sejam colhidos após sua formação inicial e, em seguida, resuspendidos em ECM14,15,16. Esta etapa de resuspensão resulta em uma perda de controle sobre a distância entre os esferoides. Uma vez que a distância entre os esferoides tumorais impacta seu comportamento invasivo, essa perda de controle introduz alta variância entre ensaios e reduz a reprodutibilidade. Além disso, a aplicação de ensaios de fracionamento celular por etapas de centrifugação consecutivas para avaliação das células imunes periféricas e tumorais infiltradas é limitada a populações de células tumorais que geram esferoides mais estáveis17.
Conceito e abordagem
Nossa abordagem aborda as deficiências acima mencionadas usando um modelo de cocultura spheroid 3D "All-in-One" — que não requer a transferência de esferoides para ensaios subsequentes. Adaptamos um dispositivo de formação de esferoides (ver Tabela de Materiais) para gerar um ensaio para monitorar simultaneamente o comportamento invasivo das células cancerosas e a citotoxicidade das células T co-cultivadas. Este método é fácil de usar, barato e permite um manuseio rápido e fácil em uma configuração 3D relativamente de alto rendimento. Dependendo do tipo de dispositivo utilizado, até 81 esferoides de grande porte uniforme podem ser gerados em uma única etapa de pipetação com controle sobre o tamanho esferoide individual modificando o número de células semeadas. A formação esferoide é forçada por interações células-células aprimoradas em elencos multi-poços livres de andaimes com fundos em forma de U. Adaptamos este sistema 3D para estudos funcionais baseados em células dinâmicas, bem como ensaios moleculares e bioquímicos que incluem fluorescência ativada de classificação celular (FACS), imunofluorescência (IF) ou imunohistoquímica (IHC), bem como análise de expressão genética da cocultura 3D intacta.
Para estudos funcionais,a incorporação de esferoides no colágeno tipo I dentro das castas agarose resulta na invasão de células cancerígenas de equidistantes e permite monitorar características essenciais da linha celular, como migração celular única vs. células coletivas18,,19. Além disso, a matriz de colágeno é facilmente separada do molde de agarose, resultando em um patch de 1\u20122 mm de espessura contendo vários esferoides, que podem ser processados para coloração de IF e imagens por microscopia confocal. Isso pode revelar distintas interações de invasão celular e matriz celular em uma triagem de alto rendimento. Além disso, as células da matriz de colágeno podem ser isoladas após a digestão do colágeno e dissociação de células únicas para posterior cultivo ou análise celular.
Para a análise de IHC de esferoides,após fixação e secção do molde de agarose, proteínas ou outras moléculas de interesse são detectáveis mantendo as posições geográficas dos esferoides. Na abordagem descrita aqui, os esferoides estão diretamente incorporados no gel de processamento de hidroxietila agarose dentro do molde de agarose e o gel serve como uma "tampa" para reter os esferoides na parte inferior dos microwells. Após a incorporação da parafina do elenco20,a seção horizontal serial é realizada com a parte inferior do elenco servindo como ponto de partida.
Essa abordagem contrasta com a secção convencional de Spheroids que requer a colheita de células antes de incorporar em gel de processamento de hidroxietilaagarose 21 e corre o risco de interrupção de esferoides, perdendo assim o arranjo espacial das células. Além disso, o fracionamento celular por centrifugação para avaliar se as células imunes infiltraram ou permaneceram periféricas aos esferoides tumorais17 é evitada pela incorporação direta.
Além disso, a cocultura 3D pode ser realizada por tumores admixantes, células estrômicas ou imunes, e, assim, estudar o crosstalk de células tumorais ou recapitular diferentes microambientes tumorais para analisar interações células-células, incluindo co-culturas com células endoteliais16.
Esta configuração de cocultura esféide 3D pode ser usada para realizar a co-cultura de diferentes tipos de células presentes no microambiente tumoral e para avaliar os efeitos dos elementos ECM alterados. Além do colágeno tipo I, outros componentes do ECM (por exemplo, matrigel, misturas de matrigel/colágeno, fibronectina), podem ser usados uma vez que a invasão de células tumorais é impactada pela abundância de diferentes substratos22. Além disso, as microiádeas do elenco de agarose são adequadas para a formação esferoide de linhas celulares primárias e para células com baixa adesão celular.

<table><tbody><tr><td>Placas de Petri 3D</td><td>Microtissues Inc</td><td>Z764019 & Z764051</td><td>referidos como "moldes de borracha" nos protocolos; moldes de 81 micropoços e 35 micropoços</td></tr><tr><td>Lâminas de câmara de 8 poços</td><td>Lab-Tek</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Tipo I, baixo EEO</td> Anticorpo secundário conjugado anti-coelho-HRP <td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agilent</td><td>K4003</td><td>pronto para uso</td></tr><tr><td>Colágeno Tipo I, Cauda de Rato, 100 mg</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo 4, 1 g</td><td>de Worthington</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, soro fetal bovino</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092, 16000044</td><td>referido como "meio de cultura celular" nos protocolos</td></tr><tr><td>Harris hematoxilina</td><td>ThermoFisher</td><td>SH30-500D</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel</td><td>ThermoFisher</td><td>HG-4000-012</td><td>referido como "processamento de hidroxietil agarose gel" nos protocolos</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>diluição 1/1000</td></tr><tr><td>Faloidina 546</td><td>Invitrogen</td><td>486624</td><td>1/200 diluição</td></tr><tr><td>coelho anticorpo anti-CD8</td><td>Sinalização Celular</td><td>98941</td><td>1/25 diluição</td></tr><tr><td>rato anti-queratina 8</td><td>DSHB</td><td>TROMA-I AB_531826</td><td>1/500 diluição</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>referido como "kit de extração de RNA" nos protocolos</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>ThermoFisher</td><td>11875093</td><td>para meio de cultura de células T</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioRad</td><td>1610407</td><td>referido como "Octoxynol" nos protocolos</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td>referido como "tiocianato de guanidínio com fenol" nos protocolos</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>referido como "polissorbato 20" nos protocolos</td></tr><tr><td>TypLE</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td>referido como "solução de enzimas de dissociação celular" nos protocolos</td></tr></tbody></table>

monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células t na cultura 3d

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Avanços significativos foram feitos no tratamento do câncer com imunoterapia, embora um grande número de cânceres permaneça resistente ao tratamento. Um número limitado de ensaios permite o monitoramento direto e insights mecanicistas sobre as interações entre tumor e células imunes, entre as quais, as células T desempenham um papel significativo na execução da resposta citotóxica do sistema imunológico adaptativo às células cancerosas. A maioria dos ensaios são baseados na co-cultura bidimensional (2D) das células devido à relativa facilidade de uso, mas com representação limitada do fenótipo de crescimento invasivo, uma das marcas das células cancerosas. Os sistemas de cocultura tridimensionais atuais (3D) exigem equipamentos especiais ou monitoramento separado para invasão de células cancerígenas co-cultivadas e células T interativas.
Aqui descrevemos uma abordagem para monitorar simultaneamente o comportamento invasivo em 3D de esferoides de células cancerosas e citotoxicidade de células T na co-cultura. A formação esferoide é impulsionada por interações células-células aprimoradas em moldes de microwell agarose livres de andaimes com fundos em forma de U. Tanto a co-cultura das células T quanto a invasão de células cancerígenas na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro das microwells dos moldes de agarose sem a necessidade de transferir as células, mantendo assim um sistema de cocultura 3D intacto durante todo o ensaio. A matriz de colágeno pode ser separada do molde de agarose, permitindo a coloração da imunofluorescência (IF) e para imagens confocal das células. Além disso, as células podem ser isoladas para maior crescimento ou submetidas a análises como para expressão genética ou fluorescência ativada de classificação celular (FACS). Finalmente, a cocultura 3D pode ser analisada pela imunohistoquímica (IHC) após a incorporação e secção. As possíveis modificações do ensaio incluem composições alteradas da matriz extracelular (ECM), bem como a inclusão de diferentes células estromais ou imunes com as células cancerosas.

O modelo de cocultura 3D permite diferentes ensaios mostrados na Figura 1A, que podem ser combinados ou modificados conforme necessário. Em nossa configuração experimental estabelecida, tumores e células T são co-cultivados por 2 dias seguidos pelo início do ensaio de invasão para seleção de células tumorais invasivas e/ou resistentes(Figura 1B). No dia 4 é realizada a quantitação da invasão e as células "sobreviventes" são isoladas da matriz de colágeno ou proc...

A abordagem apresentada avalia simultaneamente a invasão de células cancerígenas em ensaios esferoides 3D e citotoxicidade de células T. Esferoides são gerados em um elenco multi-microwell livre de andaimes. A cocultura e a incorporação na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro do mesmo dispositivo que permite monitorar a invasão de células cancerígenas e a citotoxicidade mediada por células T.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Esses métodos podem fornecer insights mecanicistas sobre citotoxicidade de células tumorais mediadas por células imunes e comportamento invasivo em um ambiente 3D. A principal vantagem dessa técnica é que este modelo de cocultura 3D esferoide não requer a transferência de esferoides para múltiplos ensaios subsequentes. Demonstrando este procedimento será Apsra Nasir, uma estudante de doutorado do nosso departamento.Para gerar os esferoides usando técnica asséptica em uma capa de cultura celular adicione 500 microliters de agarose derretida em um molde de borracha de 81 microwells tomando cuidado para evitar bolhas. Quando a agarose se solidificou cuidadosamente flexionar o molde de borracha para sair as lanças agarose em poços individuais de uma placa de 12 poços. Para equilibrar os moldes adicione 2,5 mililitros de cultura celular meio suplementado com soro bovino 10% fetal em cada poço e coloque a placa em uma incubadora de cultura celular por uma hora.No final da incubação inclinar a placa para remover o meio de cultura celular no ambiente em primeiro lugar, em seguida, na câmara de semeadura e cuidadosamente semeado 190 microliters do preparado para a suspensão de células tumor

monitoring-cancer-cell-invasion-and-t-cell-cytotoxicity-in-3d-culture

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um ensaio para medir quantitativamente Transforming Growth Factor (TGF)-β induzida por invasão em gel 3-dimensional colágeno é descrito. Este ensaio se aproveita da série MCF10A de linhas de células, que representam diferentes fases de desenvolvimento de câncer de mama. Este método pode ser adotado para ser usado com outras linhagens de células e pode ser usado para investigar outras possíveis ativadores ou inibidores de invasão.

Ensaio esferóide para TGF-β Medida induzida Invasion

Este vídeo fornece uma metodologia detalhada para cultivar células de câncer de mama em uma matriz de proteína de membrana basal 3D, exemplificando o potencial da cultura 3D na avaliação da invasão celular no ambiente circundante.

Ensaio de Membrana Basal de Cultura 3D: Cultura de Células Cancerígenas em Matriz de Proteína de Membrana Basal 3D para Estudar a Invasão Celular

Este vídeo descreve a técnica de utilização de uma matriz nativa para estudar a invasão de células tumorais. A técnica usada neste ensaio fornece a capacidade de avaliar as interações epitelial-mesenquimais em um ambiente 3D sem a necessidade de uma matriz sintética ou estranha.

Ensaio de invasão de células tumorais: um método baseado em matriz nativa 3D in vitro para avaliar as interações epitelial-mesenquimais

Este vídeo demonstra um método para estabelecer uma co-cultura tridimensional de esferóides tumorais e células T. Um molde de agarose com micropoços contendo esferóides tumorais é preparado, seguido pela adição de células T. Após a incubação, essa configuração permite estudar a interação das células T com os esferoides tumorais em um ambiente tridimensional controlado.

Um modelo tridimensional de co-cultura de células T infiltrantes em esferoides tumorais

Este artigo proporciona metodologias detalhadas para a utilização de ensaios tridimensionais (3D), para quantificar a invasão das células do cancro da mama. Especificamente, vamos discutir os procedimentos necessários para a criação de tais ensaios, quantificação e análise de dados, bem como métodos para analisar a perda da integridade da membrana que ocorre quando as células invadem.

Quantificação de cancro da mama invasiva das células usando um modelo (3D) tridimensional

A invasão dos tecidos normais circundantes é uma característica definidora dos tumores malignos. Fornecemos aqui um ensaio simples e semi-automatizado de microplacas de invasão em uma biomatriz 3D natural que foi exemplificada com vários modelos de cânceres humanos avançados.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Este método avalia a invasão de células cancerígenas de esferóides em uma matriz 3D circundante.  Os esferoides são gerados através do método de cultura de gota suspensa e, em seguida, incorporados em uma matriz composta de materiais de membrana basal e colágeno tipo I.  A invasão dos esferóides é posteriormente monitorada.

A Cancer Cell Spheroid Ensaio para avaliar a invasão em um ambiente 3D

As células cancerígenas são incorporadas em um gel de colágeno e, em seguida, ensanduichadas em um gel de fibrina acelular para gerar um sistema de cultura 3D no qual a invasividade e a formação de tumores satélites podem ser monitoradas.

Tridimensional Cultura Ensaio para Explorar Cancer Invasividade celular e formação de tumor Satélite

Os processos que regem a invasão do câncer de bexiga representam oportunidades para o desenvolvimento de terapêutico e biomarcador. Aqui nós apresentamos um modelo de invasão de câncer de bexiga que incorpora a cultura 3D de esferoides de tumor, imagem latente de lapso de tempo e microscopia confocal. Essa técnica é útil para definir as características do processo invasivo e para a seleção de agentes terapêuticos.

Sistema de cultura de células 3D para estudar a invasão e avaliação terapêutica em câncer de bexiga

Descrevemos uma abordagem para detectar e capturar subpopulações celulares invasivas em tempo real. O projeto experimental utiliza a Análise Celular em Tempo Real monitorando mudanças na impedância elétrica das células. Podem ser capturados câncer invasivo, células endoteliais ou estromais em tecidos complexos, e o impacto das co-culturas pode ser avaliado.

Detecção e Captura em Tempo Real de Subpopulações celulares invasoras de co-culturas

A invasão é um fenômeno biológico importante no desenvolvimento e progressão do câncer. Esse processo é influenciado por células não neoplásicas e componentes do microambiente tumoral. O objetivo deste estudo é descrever um método alternativo para análise da invasão de células tumorais in vitro usando culturas tridimensionais (3D).

Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

Aprenda a monitorar invasão de células cancerígenas e citotoxicidade de células T em cultura 3D usando esferoides em matriz de colágeno tipo I. Este método simplifica fluxos experimentais em imunoterapia oncológica.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

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