通过CD47衍生肽固定，缓解血系细胞附着到金属植入物

该协议包括一种将治疗肽附在金属表面的新颖化学策略，具有提高各种金属生物材料的生物相容性的潜力。这是一种通用而强大的技术，可将肽和治疗蛋白附在生物植物的裸金属表面。我们利用这项技术通过附加CD47肽来改善金属支架的生物相容性，以防止支架引起的炎症反应。

首先，用2异丙醇在摇床中清洗不锈钢箔优惠券或网状盘五分钟。进行两次洗涤，然后用氯仿清洗样品两次，每次洗涤10分钟。将清洗过的不锈钢样品在220摄氏度的烤箱中放置30分钟。

将烤箔或网盘浸入 PABT 的 0.5% 水溶液中，并在摇床中孵育一小时。用去维化蒸馏水清洗 PABT 改性样品五次。将试样转移到新瓶中，然后重复洗涤。

在摇床的室温下，用 TCEP 处理样品 15 分钟。用真空生成装置（如冻干剂）将蒸馏水除去，用脱气水洗涤铝箔或网状盘五次。将样品转移到新瓶中，然后重复洗涤。

通过稀释 212.5 微升的库存 PEI-PDT 和 125 微升 0.4 摩尔醋酸钠在脱气水中，准备 5 毫升 1%的PEI-PDT溶液。用1%的PEI-PDT孵育洗净的不锈钢试样。将空气更换为气，密封小瓶气密，并在摇床上混合一小时。

立即进行肽结合，或在四摄氏度下储存样品长达一周。通过溶解脱气50%醋酸中的人类肽CD47粉末，准备每毫升1毫克的人类肽CD47库存溶液，然后通过溶解4.5毫升脱气PBS中的500微升库存来准备工作溶液。在室温下用肽CD47的工作溶液孵育洗涤的PEI-PDT涂层样品，摇动一小时。

完成后，如文本手稿中所述，清洗多肽 CD47 涂层样品。在用肽 CD47 或炒多肽涂上金属箔后，将四分之一英寸 PVC 管切成三块 38 厘米长的碎片，并将多达八个未改性、炒多肽或肽 CD47 改性金属箔插入三个不同的管中。从健康的人类献血者那里收集30毫升血液，不含任何抗血小板药物，用一毫升4%柠檬酸钠预装注射器，以防止采集的血液凝固。

使用 10 毫升注射器将 10 毫升血液放入每个管中，并使用金属适配器连接两端。将充满血液的管子放在钱德勒循环装置的车轮上，在37摄氏度的车轮旋转下，将血液沿着金属箔传递4小时。将血液从管子中排出，然后根据 IRB 要求进行处理，然后用手术刀切割管中取回箔。

用0.1摩尔氯化钠稀释卡迪酸钠缓冲液中的70%溶液，准备2%谷胱甘肽溶液。在2%谷胱甘肽溶液中孵育铝箔15分钟，并在夜间储存在4摄氏度。在分析金属箔之前，用PBS清洗三次。

在37摄氏度的水浴中加热8毫升PBS。通过将 90 微升 DMSO 添加到一个 CFDA 小瓶中，准备 10 毫摩尔 CFDA 染料库存溶液，然后通过向温暖的 PBS 中添加 75 微升的库存 CFDA 来准备工作溶液。反转管子几次，用铝箔混合并盖住。

将每个铝箔放入一毫升 CFDA 染料中，放入 24 井板中。用铝箔盖住板，在37摄氏度下孵育板15分钟，然后在PBS中清洗铝箔三次，然后用荧光显微镜成像。对共价结合TAMRA结合肽CD47的浓度进行量化，以确定该肽在金属表面的最大固定密度。

最大肽保留量约为每厘米180毫微克，其输入浓度为每毫升100微克。在改性金属表面上对TAMRA结合肽CD47的固定性进一步证实了荧光显微镜，该显微镜显示TAMRA结合肽CD47处理网盘表面发出的荧光均匀。在缺乏修饰的控制网格表面只检测到最小的荧光，从而排除了非具体绑定的TAMRA结合肽CD47作为荧光的主要来源。

还证实，与炒改性、未经修改的肽对联控制相比，肽CD47涂层表面显示血液传播的细胞附着性大幅减少。从大鼠布衣细胞分离出的单核细胞是在裸金属和肽CD47改性不锈钢箔上培养的。在功能化表面上观察到急性单细胞附着的衰减、其向巨噬细胞的转化和巨噬细胞增殖。

在尝试此协议时，执行涉及脱气水或试剂的步骤非常重要，以尽快执行，并尽量减少接触氧气。我们的技术有选择地调节细胞与金属表面的相互作用，典型的细胞类型识别测定，如RT-PCR、流式细胞学和免疫荧光，与该技术兼容。当开发为一系列生物活性肽时，该技术有助于提高组织材料界面的生物相容性。