A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Generering av dynamiska miljöförhållanden med hjälp av en mikrofluidisk enhet med hög genomströmning
Chapters
Summary April 17th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi presenterar ett mikrofluidiskt system för hög genomströmningsstudier på komplexa livsmaskiner, som består av 1500 kulturenheter, en rad förbättrade peristaltiska pumpar och en blandningsmodul på plats. Det mikrofluidiska chippet möjliggör analys av de mycket komplexa och dynamiska mikromiljöförhållandena in vivo.
Transcript
Mikromiljö möjliggör en mycket komplex och dynamisk inklusive ständigt föränderliga cytokiner, ligands koncentration och komposition. Att skapa en liknande kulturmiljö är avgörande för in vitro-studier på komplexa livsmaskiner som stamcellsdilyssning, immunsvar och utveckling av organ på chipplattformar. Men att generera och leverera kemiska signaler av nanolitervolym och millisekunders noggrannhet är svårt att använda konventionella biomedicinska metoder som pipetting.
För att möta utmaningarna är en kulturplattform som kan växla bildförvärvsgenerering av dynamiska kombinatoriska och sekventiella signalingångar på hög efterfrågan. I detta protokoll presenteras design- och tillverkningsproceduren för en mikrofluidisk enhet. Det föreslagna mikrofluidiska chipet består av 1500 odlingsenheter, ett utbud av förbättrade peristaltiska pumpar och blandningsmodul på plats.
Vi visar att plattformen är lämplig för studier på encelliga tvådimensionella cellpopulationer och tredimensionella neurala sfärer. De komplexa och dynamiska miljöförhållandena på chip har stora effekter på neural stamcells differentiering och självförnyelse. Detaljerna i design- och tillverkningsförfarandena är följande.
Chipdesign utfördes med AutoCAD-programvara. För att passa storleken på platthållaren på mikroskopet är det mikrofluidiska chipet ungefär sju gånger fem centimeter stort och består av 1 500 kulturkammare. En av viktiga funktioner är att den har peristaltisk pump som består av åtta flödeskanaler och 200 mikrometer breda styrkanaler.
Ökningen av det överlappande området mellan kontroll och flödeskanalen ökar 16 gånger jämfört med den peristaltiska pumpen, som föreslogs av Stephen Quake 2002, till cirka 15 nanolitervätska och per pumpcykel och räcker för att upprätthålla 1 500 oberoende miljöförhållanden parallellt på chip. En annan viktig del av enheten är en tvåskikts kulturkammare, som kan upprätthålla savfri kulturmiljö. Den oönskade savspänningen förhindras genom att rikta den snabbt genom det övre lagret.
Cellerna, vävnaderna och det avgörande villkorliga mediet förblir orörda i bottenskiktet. Numerisk simulering tyder på att när vätskorna riktas genom kulturkammare, från vänster till höger. savkrafterna kan effektivt förhindras.
Även vid en ingångsflödeshastighet på 10 millimeter per sekund förblir cell- eller mikrometerstor vävnad ostörd längst ner på odlingsenheten. Vi tillverkade replika gjutning eller kisel wafer med UV litografi. De fluidiska kanalerna på 25 mikrometer i höjd och 100 mikrometer i vikt produceras med SU-8 3025 negativ fotoresist.
Kulturkamrarna på 75 mikrometer och 150 mikrometer i höjd tillverkades med SU-8 3075 fotoresist. AZ50X positiv fotoresist används för de rundformade brunnsfunktionerna som överlappar kontrollkanalerna för att säkerställa en bra anslutning. För att producera det mikrofludiska chipet behandlades de mönstrade och tomma kiselplattorna först med TMCS.
Olika mängder PDMS 10 till 1 monomer till katalysator förhållandet var grundligt blandade och debubbled i en till två timmar i vakuum kammaren på minus 0,85 megapascal. Kontrollskiktet erhölls genom spinnbeläggning PDMS vid 2 200 RPM. Kiselplattorna överfördes sedan till inkubatorn och inkuberades i 60 minuter vid 80 centigrade.
Olika lager var justerade och bundna tillsammans med hjälp av anpassad optisk enhet och plasma etsningsmaskin. Inloppshålen slogs sedan efter ytterligare två timmars termisk bindning vid 80 centigrade. Chippet var bunden till en PDMS-belagd täckspjut, som är lika stor som 96-brunnsplattan och härdad i minst 12 timmar vid 80 centrigrade före användning.
För drift var styrkanaler anslutna till miniatyr pneumatiska solenoidventiler genom plaströr. Vändningen av alla penumatiska brunnar kontrollerades av ett anpassat MATLAB-program genom det grafiska användargränssnittet. Optimala stängningstryck av push-up PDMS membranventiler bestämdes individuellt för varje chip, som vanligtvis sträcker sig från 25 till 30 PSI.
Genom att vrida alla serier av brunnar dynamiskt kombinatoriska och sekventiella ingångar kan genereras på chip. Cellerna skördades vid 80% confluency och återanvändes med odlingsmedium DMEM med en densitet ca 10 till kraften sex per milliliter, som sedan laddades in i chipet genom att trycksatta cellen som innehåller lösning. För både vidhäftande och suspension kultur av neuro stamceller samlades celler och sfärerna laddades direkt i chipet.
För bildförvärv användes ett inverterat mikroskop med ett automatiskt translationellt stadium och den digitala kompletterande halvledarkameran för metalloxid. Scen- och bildförvärvet kontrollerades via programvaran visar det övre vänstra hörnet och nedre högra hörnkamrarna som valpunkter och flytta översättningsstadiet till punkterna ordnat för att få den preliminära avbildningen med 4x objektiv. Ändra 4x objektivet med 20x ett och justera bildparametrar inklusive ljusintensitet, exponera tid, etc.
Leta sedan reda på de valda punkterna så att positionen för varje kammare lämnar matrisen 13 med 15 kammare eller definieras automatiskt av programmet. Vid bestämning av kamrarnas koordinater flyttas översättningssteget till varje kammare där X, Y, Z-fokalplanet kan finjusteras. Ställ in intervallet och avbildningscykelns längd.
Spara sökvägen och starta sedan avbildningen. Detta system är tillgängligt för olika måldynamisk spårning, såsom neurala stamceller differentiering i brightfield och fluorescensfältet i processen för neurala stamceller sfärbildning. Dataanalys.
Ändra formatet i nd2 till Tif med hjälp av det anpassade MATLAB-programmet. Och dela upp data efter poäng. Markera objekt som ska analyseras är cell eller vävnad.
Ange tröskelvärdet, objektstorleken, brusstorleken som ska analyseras. Eller så kan du välja steg-för-steg-analys till optimala parametrar. Och sedan analysera all data.
När du har sparat resultatet i MAT-format, använd tomten för att rita resultaten eller spåren. I detta dokument beskrev vi protokollet för och kulturen av hög genomströmning mikrofluidic chip system baserat på fotolitografi teknik för levande cell microenvironment dynamisk kontroll. Vi beskrev också några parametrar som man noggrant bör kontrollera såsom stängningstrycket på PDMS-membranventiler och spinnkontrollen av vätska parallellt med kammaren.
I traditionell cellin vitro-kultur utförs behandlingen av cellkulturmiljö manuellt, vilket är tidskrävande och mödosamt och vätskefyllt är inte lätt att standardkontroll. Särskilt minuter av lösning. Det finns vissa problem som att generera insatsvaror, immunläkemedelskoncentration och stor konsumtion.
Men med hjälp av vårt mikrofluidiska system är det möjligt att upprepa det som stimulator vid en fast dos enda vätska lika stor mängd enhetlig koncentration, jämföra olika kulturer i olika kulturkammare samtidigt. Annorlunda med någon miniatyr temporal upplösning tillbaka stimulans och med subsetting upplösningen genom att reglera vätskan. Dessutom kan vårt system få ett stort antal jämförande experimentella resultat genom enkla operationer.
Vårt system bygger på diffusionsprincipen, skapar minimal mekanisk störning av cellulär mikromiljö. För stabilare cellulära mikromiljöchips kan du öka listan över buffertskiktet som odlingsskiktets djup eller minska ingångsvätskan för medium utbyte, det vill säga minska trycket, som kommer att vara här för forskning om cellbeteende. Det bör märkas att denna studie endast har undersökt kulturen hos 3T3- och NSC-celler.
För andra celler eller cellinjer är odlingsförhållandena jämförbara med våra parametrar för att justera den.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
