Vasküler Perfüzyon-Fiksasyon ile Murine Akciğerlerinin Hava-Enflasyonu

Bu, yapısal ve fonksiyonel analizler için akciğerleri korumak için hava enflasyonu ve vasküler perfüzyon fiksasyonunun avantajlarını birleştiren ucuz bir yöntemdir. Bu tekniğin temel avantajı hem hücre morfolojisinin hem de akciğerin hava sahalarındaki konumunun korunmasıdır. Yeterli şişirme ve fiksasyon sağlamak için yem koçan adaptörünü nefes borusuna ve perfüzyon iğnesini sağ ventrikül içine yerleştirirken dikkatli olunmalıdır.

Hava şişirme cihazını kurmak için, su sütunu için bir şırınnayı bir halka tutucuya yerleştirin ve hayvan platformundan su sütununda 25 santimetreye kadar dikey yüksekliği ölçün. Su sütunu tüpünün ucuna hava haznesinde stopcock’a takın ve hava odasının dişi cazibesinden hayvan işleme kabındaki stopcock’a bir tüp takın. Hava haznesine kapağın ve hayvan işleme kabının dışındaki stopcockun kapalı olduğunu ve su kolonundan hava şişirme odasına giden boru üzerindeki stopcock’un açık olduğunu onaylayın.

Daha sonra şırınnayı 25 santimetre işaretine kadar suyla doldurun. Şırındır ve borudan hava haznesine su akacak. Basınç eşitlendikten sonra, su akmayı durduracaktır.

Akciğerleri enflasyona hazırlamak için ötenazili farenin göğüs kafesinin altındaki karın duvarında bir yanal kesi, kalçaların üzerinde ikinci bir yanal karın duvarı kesisi yapın. İç kesiden üst kesiye doğru orta çizgi boyunca kesin ve diyaframın yan tarafına dikkatlice bir kesi yapmak için künt makas kullanın. Diyafram delinmez akciğerler çökmelidir.

Torasik boşluğu açmak için diyafram boyunca enine kesin ve kalbi ve akciğerleri tamamen açığa çıkarmak için sternum boyunca xiphoid işleminden hokkabaz çentiğine ve yanal olarak göğüs kafesinin üstünden üstün bir şekilde kesin. Göğüs kafesinin kenarlarını sabitle ve boyunda, nefes borusunun üstünde bir orta çizgi kesisi yapın. Trakeayı çevreleyen deri, kas, tiroid bezi ve bağ dokusunu çıkarın ve arka trakeanın altına iki parça dikiş kaydırmak için kavisli tokalar kullanın.

Şişirme saplama adaptörünü yerinde tutmak için bir parça dikiş kullanın ve nefes borusunda küçük bir delik açmak için 18 inçlik bir iğne kullanın. Deliğe 20 kalibrelik bir yem saplama adaptörü yerleştirin ve dikişi nefes borusunun etrafına hemen, yem saplamayı benimseyenin deliğe girdiği yere bağlayın. Daha sonra hayvanı hayvan işleme kabına aktarın ve yem saplama adaptörünü hayvan işleme kabının içindeki dişi yemlere takın.

Akciğerleri şişirmek için, perfüzyon aparatına bağlı 25 ölçerin kalbin sağ ventrikülüne bağlı 5/8 inç iğneyi yerleştirin ve kanın kalpten akmasını sağlamak ve akciğerlerden perfüzyon akışını teşvik etmek için karın aortunu kesin. Hayvan işleme kabının dışındaki stopcock’u açın ve şırınnadaki su seviyesinin çok hızlı azalmamasına dikkat ederken akciğerleri beş dakika boyunca 25 santimetre suda şişirin. Akciğer şişirmenin son dakikasında peristaltik pompayı dakikada 10 mililitre akış hızına açın.

Heparin çözeltisi şişeden borudan hayvana akmalıdır. Akciğerleri beş dakika şişirdikten sonra pompayı kapatın ve perfüzyonu heparinden fiksatife geçirin. Su sütunu şırındını 20 santimetreye 20 santimetreye dirin.

Basınç değiştikçe hava kabarcıklarının su kolonu içinde hareket etmesi normaldir. Şırınddaki su seviyesini kontrol edin. 25 santimetre işarette olmalı.

Ardından, pompayı 10 ila 15 dakika boyunca dakikada 6,5 mililitre debide, damar fiksatif perfüzyonda yeniden başlatmadan önce akciğerlerin 25 ila 20 santimetre su basıncını söndürmesine izin vermek için bir dakika bekleyin. Şişirilmiş ve sabit akciğer dokusunun çıkarılması için, ikinci iplik parçasını nefes borusunun etrafına sıkıca bağlayın, yem saplama adaptörüne distal ve yem saplama adaptörünü nefes borusundan çıkarın. İğneyi kalpten çıkarın ve bağ dokusunu kesmek için künt makas kullanın, mediastinumun posterior, akciğerleri ve kalbi torasik boşluktan kurtarmak için akciğerlerin delinmemesine dikkat edin.

Kalbi akciğerlerden dikkatlice çıkarın ve akciğerleri 50 mililitrelik konik bir tüpe 20 ila 25 mililitre fiksatif yerleştirin. Nefes borusunu tutarak dikişi konik tüpteki açıklıktan çekin ve dikişi kapağın ipliklerinden sabitleyin. Daha sonra şamandıra, hava şişirilmiş akciğerlerin fiksatif olarak tamamen su altında kalmasını sağlamak için tüpü ters çevirin ve akciğerleri standart protokollere göre histolojik çalışmalar için işleyin.

Diseksiyon sırasında diyaframa girildiğinde plevral alanın bütünlüğü kaldırılacak ve akciğerler çökmelidir. 25 santimetre su basıncı uygulanması üzerine hava nefes borusundan akciğerlere girecek ve enflasyona kolayca uyulmalıdır. Akciğerler tamamen genişledikten sonra, aşırı dedtens olmadan akciğerleri şişirmek için enflasyon basıncı 20 santimetreye kadar düşebilir.

Akciğerler trakeal ligasyon ve torakstan çıkarıldıktan sonra şişirilmiş kalmalıdır. Hayvan hazırlığı veya akciğer çekimi sırasında akciğerler delinirse deflasyon meydana gelebilir. Şişirilmiş akciğer bölümlerinin histolojik analizi, geleneksel sıvı bazlı enflasyon kullanılarak sabitlenen dokuların hava yolu lümeninde çok az sayıda bağışıklık hücresi bulunduğunu ortaya koymaktadır.

Buna karşılık, enflamatuar hücreler hava enflasyonu ile vasküler perfüzyon yoluyla sabitlenmiş dokuların hava sahalarında korunur. Bol miktarda fiksasyon ile hava enflasyonunu takiben, akciğer dokusu doku kesitleme için formalin içine gömülebilir ve daha sonra lekelenme, immünohistokimya ve immünofluoresan görüntüleme dahil olmak üzere histoloji teknikleri ile analiz edilebilir.