Bioengineering
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माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करके जीन डिलीवरी के लिए लिपिड नैनोकणों को तैयार करना और उनकी विशेषता करना
Chapters
Summary February 25th, 2021
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लिपिड नैनोकणों को एमआरएनए और डीएनए एनकैप्सुलेशन के लिए माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग प्लेटफॉर्म दृष्टिकोण का उपयोग करके विकसित किया जाता है।
Transcript
इस प्रोटोकॉल का उपयोग उच्च प्रजनन क्षमता और गति और कम मात्रा के साथ न्यूक्लिक एसिड एनक्लोजेटेड लिपिड नैनोकणों का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है। नैदानिक आवेदन के आधार पर वांछित जैव वितरण प्राप्त करने के लिए निर्माण मापदंडों को ट्यून किया जा सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक कारतूस का मानक हेरिंगबोन डिजाइन मिश्रण के दौरान एक तेजी से, सटीक और नियंत्रित लेमिनार प्रवाह की अनुमति देता है।
विधि स्केलिंग के लिए उत्तरदायी है और समान, अत्यधिक समझाया कणों को उत्पन्न करती है। वायरल तरीकों पर निर्भर सबसे व्यावसायिक रूप से अनुमोदित जीन थेरेपी उत्पादों के साथ, यह प्रक्रिया जीन वितरण में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, क्योंकि इसका गैर-वायरल दृष्टिकोण उन अनुप्रयोगों की अनुमति देता है जिनके लिए दोहराने की डोजिंग आवश्यक है। रुक-रुक कर भंवर के साथ एक गिलास शीशी में प्रत्येक तरल स्टॉक समाधान की उचित मात्रा जोड़कर शुरू करें।
जैसा कि तालिका में दर्शाया गया है, इसके बाद 200 प्रूफ इथेनॉल को 533 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में जोड़ा गया है। फिर वांछित एकाग्रता पर 1.5 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए मॉन्स वेक स्टॉक और पतला साइट्रेट बफर के साथ उचित मात्रा में जोड़ें। माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों को प्राइम करने के लिए, सबसे पहले टेबल में उल्लिखित इंस्ट्रूमेंट सॉफ्टवेयर में प्राइमिंग पैरामीटर दर्ज करें।
इसके बाद, उपकरण ढक्कन खोलें और घूर्णन ब्लॉक में एक माइक्रोफ्लुइडिक कारतूस रखें। एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में इथेनॉल के कम से कम 500 माइक्रोलीटर लोड करें, इस बात का ख्याल रखते हुए कि सिरिंज टिप पर कोई बुलबुले या हवा अंतराल नहीं हैं और सिरिंज को कारतूस के दाहिने प्रवेश में डालें। साइट्रेट बफर के 1.5 मिलीलीटर के साथ पांच मिलीलीटर सिरिंज लोड करें, यह ध्यान रखें कि कोई हवा के बुलबुले या अंतराल नहीं हैं, और सिरिंज को कारतूस के बाएं प्रवेश में डालें।
अपशिष्ट कंटेनरों के रूप में सेवा करने के लिए क्लिप धारकों में दो 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब रखें और समाधान मिश्रण करने के लिए "क्लिक करें" जाएं। जब उपकरण नीचे नीली रोशनी बंद होने से संकेत के रूप में भड़काना बंद हो जाता है, देर से खोलने के लिए और ठीक से शंकु ट्यूबों और सीरिंज का निपटान । लिपिड नैनोपार्टिकल गठन के लिए, तालिका में दर्शाए गए उपयुक्त निर्माण मापदंडों को निर्धारित करें और पहले से तैयार लिपिड मिश्रण के साथ 1 मिलीलीटर सिरिंज लोड करें।
सिरिंज टिप में किसी भी हवा अंतराल या बुलबुले को हटा दें और कारतूस के दाईं ओर सिरिंज डालें। पहले से तैयार न्यूक्लिक एसिड समाधान को 3 मिलीलीटर सिरिंज में लोड करें, इस बात का ख्याल रखें कि सिरिंज टिप में कोई बुलबुले या हवा के अंतराल नहीं हैं, और सिरिंज को कारतूस के बाएं प्रवेश में डालें। बाएं ट्यूब क्लिप में नमूना नाम के साथ लेबल एक 15 मिलीलीटर RNAase मुक्त शंकु ट्यूब रखें और सही ट्यूब क्लिप में एक 15 मिलीलीटर अपशिष्ट शंकु रखें ।
उपकरण ढक्कन बंद करो और Go.लिपिड और mRNA समाधान माइक्रोफ्लुइडिक कारतूस के माध्यम से प्रवाह होगा और लिपिड नैनोकण समाधान शंकु ट्यूबों में एकत्र किया जाएगा । निर्माण प्रक्रिया के अंत में शंकु नली को बनाए रखें, फिर पीबीएस के 5 मिलीलीटर और जैविक सुरक्षा कैबिनेट के साथ लिपिड नैनोकणों को पतला करें। बफर एक्सचेंज करने के लिए, पहले पीबीएस, सेंट्रलाइज के 2 मिलीलीटर के साथ 100 किलोडलटन पोर आकार अल्ट्रासेंट्रफ्यूज फिल्टर को प्रीवॉश करें, और फिर नीचे के डिब्बे से पीबीएस खाली करें।
तीन अपकेंद्रित्र वॉश के लिए पूर्व-धोए गए अल्ट्रासेंट्रफ्यूज फिल्टर के शीर्ष डिब्बे में पतला लिपिड नैनोकणों को जोड़ें, प्रवाह के माध्यम से त्यागें और पहले दो वॉश के बाद अल्ट्रासेंट्रफ्यूज फिल्टर में पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ें। अंतिम धोने के बाद, एक नाभिक मुक्त शीशी के लिए नैनोपार्टिकल समाधान स्थानांतरित करने से पहले नैनोपार्टिकल नुकसान को कम करने के लिए कई बार अल्ट्रासेंट्रफ्यूज फिल्टर की दीवारों के खिलाफ लिपिड नैनोपार्टिकल समाधान पिपेट करें। फिर आवश्यक के रूप में उचित प्रयोगात्मक एकाग्रता और मात्रा के लिए नैनोपार्टिकल निलंबन लाने के लिए पीबीएस जोड़ें।
लिपिड नैनोकणों की एनकैप्सुलेशन दक्षता का आकलन करने के लिए, पहले पीबीएस में काम करने वाले न्यूक्लिक एसिड समाधान के दो गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने को तैयार करें ताकि एक मानक वक्र उत्पन्न हो सके, जो 500 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर से शुरू होता है और कम से कम पांच कमजोर पड़ने लगता है। इसके बाद, मानक वक्र के मध्य बिंदु के आसपास स्थित एक उपयुक्त सैद्धांतिक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पीबीएस में नैनोपार्टिकल नमूना कमजोर पड़ने तैयार करें। फिर आरएनए रिएजेंट, ट्राइटन X100 और पीबीएस की उचित मात्रा को मिलाकर लिपिड नैनोपार्टिकल के अंदर और बाहर दोनों आरएनए की उपस्थिति का पता लगाने के लिए राइबो ग्रीन आरएनए रिएजेंट तैयार करें।
फिर, तरल नैनोपार्टिकल के बाहर आरएनए की उपस्थिति का पता लगाने के लिए, केवल आरएनए रिएजेंट्स और पीबीएस की उचित मात्रा को मिलाएं। न्यूक्लिक एसिड मानक और लिपिड नैनोपार्टिकल समाधानों को काले फ्लोरेसेंस-सक्षम 96 अच्छी प्लेट में लोड प्रतिकृति, फिर आरएनए क्वांटिफिकेशन रिएजेंट की बराबर मात्रा जोड़ें, और ट्राइटन X100 के बिना मानक और नमूना प्रतिकृति में जोड़ें। कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए थाली पाठक में थाली हिला नमूनों की एक पूरी तरह से मिश्रण प्राप्त करने के लिए, तो ४८० नैनोमीटर की एक उत्तेजन तरंग दैर्ध्य और ५२० नैनोमीटर की एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर एक माइक्रोप्लेट रीडर पर फ्लोरेसेंस उपाय ।
लिपिड नैनोकणों के हाइड्रोडायनामिक आकार और पॉली फैलाव को मापने के लिए, पहले पीबीएस में नैनोपार्टिकल समाधान को 40 बार पतला करें और एक अर्ध माइक्रो क्यूवेट में समाधान जोड़ें। जेटासाइज़र पर क्यूवेट लोड करें और अपनी सामग्री, फैलाव, तापमान और सेल प्रकार के अनुसार नैनोकणों को मापने के लिए उपकरण निर्धारित करने के लिए एक मानक ऑपरेटिंग प्रक्रिया का चयन करें। फिर क्लिक करें "लिपिड नैनोकणों के हाइड्रोडायनामिक आकार और पॉली फैलाव को मापने के लिए शुरू करें।
लिपिड नैनोकणों की जीटा क्षमता को मापने के लिए, नाभिक मुक्त पानी में नैनोपार्टिकल समाधान को 40 बार पतला करें और समाधान को भरने की रेखा में एक क्यूवेट में लोड करें। एक जीटा संभावित विश्लेषक में cuvette लोड, ध्यान रखना है कि इलेक्ट्रोड उपकरण के साथ संपर्क करते हैं, और लिपिड नैनोकणों के विशिष्ट श्रृंगार के अनुसार जीटा क्षमता को मापने के लिए साधन सेट । फिर जेटा लिपिड नैनोपार्टिकल क्षमता को मापने के लिए स्टार्ट "पर क्लिक करें।
इस विश्लेषण में, तकनीक की प्रजनन क्षमता को प्रदर्शित करने के लिए एक ही लिपिड फॉर्मूलेशन और अमीन से फॉस्फेट अनुपात के साथ लिपिड नैनोकणों के कई बैच अलग-अलग दिनों में विकसित किए गए थे। जैसा कि देखा गया है, बैचों को एक और दो ने समान पॉली फैलाव के साथ ओवरलैपिंग आकार वितरण प्रदर्शित किया, जिसमें बैचों के बीच आकार या एनकैप्सुलेशन दक्षता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया। आमतौर पर, निर्माण मापदंडों में परिवर्तन कुछ छोटे अभी तक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर प्रेरित करते हैं।
उदाहरण के लिए, फॉस्फेट अनुपात में अमीन को कम करने के परिणामस्वरूप नैनोकणों के हाइड्रोडायनामिक व्यास में सहवर्ती वृद्धि के साथ एनकैप्सुलेशन दक्षता में 4% की कमी होती है। लिपिड नैनोकणों को विभिन्न आयनित लिपिड के साथ तैयार किया गया है लेकिन फॉस्फेट अनुपात के लिए एक ही अमीन, एनकैप्सुलेशन दक्षता में महत्वपूर्ण परिवर्तन के साथ-साथ कण व्यास में मामूली अंतर प्रदर्शित करता है। प्लाज्मिड डीएनए के एनकैप्सुलेशन के परिणामस्वरूप एमआरए की तुलना में बड़े कणों में लिपिड नैनोकणों को एनकैप्सुलेट किया जाता है, हालांकि दोनों प्रकार के नैनोकण एक समान एनकैप्सुलेशन दक्षता प्रदर्शित करते हैं।
प्रवाह दर प्रक्रिया पैरामीटर में परिवर्तन, हालांकि, लिपिड नैनोपार्टिकल विकास को प्रभावित नहीं करते हैं। लिपिड नैनोकणों में महान अनुप्रयोग हैं, इसका सही उदाहरण हाल ही में अनुमोदित COVID-19 टीके हैं। यह तकनीक एक महान उपकरण सेट के रूप में कार्य करती है और निचले अंग निर्माण स्क्रीनिंग की अनुमति देकर भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए मार्ग प्रशस्त करती है।
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