Biology
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अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए एक चुंबकीय-मनका आधारित मच्छर डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल
Chapters
Summary April 15th, 2021
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यहां वर्णित मच्छरों से उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए निष्कर्षण का उत्पादन करने के लिए चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके एक डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल है। ये निष्कर्षण एक डाउनस्ट्रीम अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त हैं।
Transcript
यह बजट के अनुकूल चुंबकीय मनका आधारित डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण संसाधन सीमित प्रयोगशालाओं और अध्ययनों के लिए सुलभ बनाता है । इस प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए निष्कर्षण के लिए महंगे उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और यह कुछ नैदानिक या अनुसंधान स्थितियों में सहायक हो सकता है जहां उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए गुणवत्ता के साथ डीएनए की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल को एक बार प्रदर्शन के साथ दोहराने के लिए आसान है।
वर्कफ्लो से परिचित होने के लिए पहले नमूनों की एक छोटी संख्या के साथ यह कोशिश की जानी चाहिए। शुरू करने के लिए, पीसीआर ग्रेड पानी के 100 माइक्रोलीटर जोड़कर 70% से अधिक अल्कोहल में संग्रहित मच्छर ऊतक नमूनों को हाइड्रेट करें और ऊतक को नरम करने के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेटिंग करें। इनक्यूबेशन के बाद पानी को त्याग दें और इसमें प्रोटीनेज के बफर एंजाइम मिक्स के 100 माइक्रोलीटर डालें।
फिर ऊतक को समरूप बनाने के लिए माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब मूसल का उपयोग करें। समरूपता के बाद, ऊतक को 56 डिग्री सेल्सियस पर दो से तीन घंटे तक और थोड़ा-स करते हैं। डीएनए निकालने के लिए, ऊतक के पिपेट 100 माइक्रोलीटर एक नई स्वच्छ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में बदल जाते हैं।
इसके बाद इसमें मैग्नेटिक मनका मास्टर मिक्स के 215 माइक्रोलीटर डालें। एक पिपेट का उपयोग करके, लिसेट और चुंबकीय मोतियों के मिश्रण को 10 से 20 सेकंड के लिए मिलाएं, फिर इसे कमरे के तापमान पर 10 मिनट तक खड़े रहने दें। इनक्यूबेशन के दौरान, चुंबकीय मोतियों के लिए डीएनए के बाध्यकारी को अधिकतम करने के लिए कभी-कभी ट्यूब को धीरे-धीरे हिलाएं।
इसके बाद, ट्यूब को चुंबकीय मनका विभाजक पर तब तक रखें जब तक कि समाधान स्पष्ट न हो जाए। फिर एक पिपेट का उपयोग करके, डीएनए को पकड़े चुंबकीय मोतियों को परेशान किए बिना ट्यूब से तरल को धीरे से एस्पिरेट करें। ट्यूब को चुंबकीय मनका विभाजक से दूर ले जाएं और बफर एक धोने के 325 माइक्रोलीटर जोड़कर मोतियों को धोएं।
कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए पाइपिंग और इनक्यूबेट करके अच्छी तरह से मिलाएं। इनक्यूबेशन के बाद, ट्यूब को चुंबकीय मनका विभाजक पर रखें और पहले के रूप में प्रदर्शित सुपरनैंट को हटा दें, फिर ट्यूब को चुंबकीय मनका विभाजक से दूर ले जाएं और एक बार बफर को धोने के साथ मोतियों को धोएं। बफर वन के साथ दूसरा धोने के बाद, मोतियों को एक ही तरीके से दो तरह से धोने वाले बफर के 250 माइक्रोलीटर के साथ दो बार धोएं।
आखिरी वॉश के बाद ट्यूब को मैग्नेटिक मनका सेपरेटर से दूर ले जाएं और एल्यूशन बफर के 100 माइक्रोलीटर डालें। पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं और फिर ट्यूब को चुंबकीय विभाजक पर वापस रखने से पहले कमरे के तापमान पर दो मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। जब समाधान स्पष्ट हो जाता है, तो सुपरनिटेंट को एक नए, स्वच्छ 0.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और उचित रूप से स्टोर करें।
यहां 0.5 मिलीमोलर ईडीटीए वाले एल्यूशन बफर में मच्छर डीएनए के एक विशिष्ट माइक्रोवोल्ट फ्लोरोमीटर पढ़ने के रूप में दिखाया गया है। औसत 260 से 280 नैनोमीटर अवशोषण अनुपात 2.3 है। यह तालिका विभिन्न निष्कर्षण विधियों के लिए एक कार्य दिवस में संसाधित नमूनों की लागत और संख्या को दर्शाती है।
इस प्रोटोकॉल द्वारा निष्कर्षण के लिए विशिष्ट अभिकर्मक और उपभोग्य लागत प्रति नमूना लगभग 9.50 है। यह लागत किसी भी विशिष्ट चुंबकीय मनका आधारित निष्कर्षण विधि के बराबर है। इस प्रोटोकॉल का प्रमुख लागत लाभ स्वचालित डीएनए निष्कर्षण उपकरण की आवश्यकता नहीं से आता है।
कई नमूनों के साथ काम करते समय डीएनए के क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए नमूनों के बीच पिपेट युक्तियां बदलना सुनिश्चित करें। हम पूरे जीनोम अनुक्रमण के लिए इस विधि का उपयोग कर निकाले गए उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए का उपयोग करते हैं। वर्तमान में हम अनुक्रमण डेटा का उपयोग कर रहे है कीटनाशक प्रतिरोध या सार्वजनिक स्वास्थ्य और रोग नियंत्रण में चिंता की प्रतिरक्षा जीन में उपंयास उत्परिवर्तन की पहचान ।
उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए किफायती समाधान होने से मच्छर फैलाव और जीन प्रवाह को समझने के उद्देश्य से जनसंख्या जीनोमिक्स और लैंडस्केप जीनोमिक्स के लिए रोमांचक दरवाजे खुलते हैं जो कई उपन्यास आनुवंशिक नियंत्रण रणनीतियों की सफलता को प्रभावित करते हैं।
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