Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Reactivación de células madre neurales en explantes cerebrales de Drosophila cultivados
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Se ha establecido un método para reactivar las células madre neurales inactivas en explantes cerebrales de Drosophila cultivados. Usando este método, el papel de las señales sistémicas se puede desacoplar de las señales intrínsecas del tejido en la regulación de la inactividad, entrada y salida de las células madre neurales.
Transcript
Desarrollamos un método para reactivar células madre neurales inactivas en explantes cerebrales de drosophila cultivados. Este método puede suministrar factores exógenos a los medios de cultivo y puede evaluar la reactivación de neuroblastos. Se podrían desarrollar mejores terapias con células madre mediante una mejor comprensión de cómo las células madre inactivas responden a las señales extrínsecas y entran en el ciclo celular.
Demostrando el procedimiento estará Susan Doyle, una científica investigadora de mi laboratorio. Para comenzar, escoja cuidadosamente aproximadamente de 20 a 25 larvas recién eclosionadas de la placa de agar de uva bajo un microscopio de disección. Llene una placa de Petri con aproximadamente dos mililitros de PBS y sumerja la punta de la herramienta que contiene larvas en PBS durante dos minutos.
Después de dos minutos, incline el plato en ángulo para acumular el líquido en la parte inferior, y con un pincel pequeño, cepille las larvas del líquido hasta el fondo de la placa de Petri. Recoja todas las larvas en el pincel y enjuague las larvas brevemente en etanol al 70% antes de transferirlas de nuevo a la placa de Petri que contiene PBS. Rocíe el área de trabajo, las herramientas de disección, las pinzas y dos platos de reloj de vidrio con etanol al 70% y déjelos secar en el banco.
Haga el medio de cultivo de Schneider suplementado, o SSM, y colóquelo en hielo. Pipetee un mililitro del medio en cada plato de reloj de vidrio. Usando una micropipeta con una punta estéril, transfiera las larvas recién eclosionadas de la placa de PBS al SSM en la primera placa de reloj de vidrio.
Diseccionar los cerebros de las larvas colocadas en la segunda placa de reloj de vidrio con SSM usando fórceps bajo un microscopio de disección y ajustando el aumento según sea necesario. Use un fórceps para agarrar los ganchos de la boca, y con el otro, agarre suavemente el cuerpo hasta la mitad y tire en la dirección opuesta para dividir la larva en dos pedazos. Después de diseccionar de 15 a 20 cerebros, agregue un mililitro de SSM en un pozo de una bandeja de cultivo estéril de 24 pocillos.
Usando una micropipeta y una punta estéril, transfiera los cerebros recién diseccionados al SSM, seguido de la incubación de los medios con cerebros durante 24 horas a 25 grados centígrados. Pipetear 10 microlitros de una cepa de 10 milimolares de 5-etinil-2'desoxiuridina, o EDU, con 990 microlitros de SSM en un tubo de microcentrífuga estéril, mezclar, luego pipetear un mililitro de EDU SSM en un pozo de la bandeja de cultivo estéril de 12 pocillos. Transfiera los cerebros usando una micropipeta con una punta estéril del pozo que contiene SSM al nuevo pozo que contiene la solución EDU SSM e incube durante una hora a 25 grados Celsius.
A continuación, transfiera los cerebros marcados con EDU a otro pozo en la misma bandeja de cultivo que contenga un mililitro de fijador y permita que los cerebros se fijen durante 20 minutos. Después de la fijación, transfiera rápidamente los cerebros a un minitray de 72 pocillos usando una micropipeta. Enjuague los cerebros tres veces en 10 microlitros de PBT y repita tres lavados durante 10 minutos cada uno, asegurándose de que los cerebros estén siempre cubiertos con un poco de líquido.
Pipete 10 microlitros de solución de bloqueo en los cerebros. Cubra la bandeja y séllela con una tira de parafilm alrededor del borde. La figura muestra células neuroblásticas EDU positivas y positivas para EDU de gran tamaño después de 24 horas de cultivo en SSM con insulina y tinción.
Después de 24 horas en los medios suplementados de Schneider sin insulina, los cerebros de tipo salvaje Oregon R recién eclosionados no tenían células neuroblásticas EDU positivas y positivas para NO DE GRAN TAMAÑO, aparte de las células neuroblásticas de cuatro cuerpos de hongos y una célula neuroblástica ventrolateral. Durante las imágenes confocales, ocasionalmente se observaron algunos hemisferios cerebrales con daño, como agujeros de tamaño pequeño a grande en el tejido cerebral explantado. Ningún cerebro con agujeros no se utilizó para el análisis.
Diseccionar los tejidos con cuidado y pipetear suavemente para evitar cualquier daño tisular. También trate de ser lo más estéril posible y no contaminar sus cultivos. Debido a que los medios de cultivo se pueden manipular fácilmente agregando diferentes factores, esta técnica se puede utilizar para abordar hipótesis futuras con respecto a la señalización extrínseca y la entrada y salida de la inactividad neuroblástica.
Tags
Neurociencia Número 183Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
