Una pipeline per caratterizzare i difetti cardiaci strutturali nel topo fetale

Questo protocollo delinea metodi all’avanguardia per la generazione di dati di imaging ad alta risoluzione per la diagnosi di difetti cardiaci congeniti. Conduciamo valutazioni funzionali con ecocardiografia fetale non invasiva combinata con necroscopia seguita da istopatologia episcopale di microscopia confocale per generare pile seriali di immagini 2D e ricostruzioni 3D per una diagnosi completa di CHD. Questo metodo può chiarire i cambiamenti anatomici dettagliati non solo nelle malattie cardiache congenite, ma può anche essere utilizzato per studiare difetti strutturali alla nascita in altri organi, inclusi difetti facciali cranici, anomalie degli arti e scheletrici, nonché difetti del cervello e di altri organi viscerali.

A dimostrare queste procedure saranno Meghan Holbrook, Carla Guzman, Peizhao Zhang e Benjamin Glennon, tutti ricercatori del nostro laboratorio. Dopo aver preparato il mouse per la procedura, riscaldare il gel ad ultrasuoni a temperatura corporea e applicarlo generosamente sull’area di imaging. Quindi posizionare il trasduttore sull’addome orientato su un piano orizzontale e identificare la vescica sullo schermo.

Una volta identificata la vescica, eseguire la scansione cranica dalla vescica, cercare il feto e determinare l’età gestazionale misurando la corona alla lunghezza della groppa. Quindi, utilizzare il color doppler per analizzare il flusso sanguigno dal cuore. Per consentire la penetrazione fissativa negli organi interni, praticare incisioni nel torace laterale e nell’addome usando una pinza o forbici da dissezione e lasciare che il campione si fissi per almeno 24 ore in una cella frigorifera.

Quindi impostare il software per salvare le immagini con un nome, inclusa l’identificazione del campione, l’ingrandimento del microscopio e il contenuto dell’immagine. Appuntare il campione attraverso i polsi e le caviglie. Prima di tagliare la pelle lungo l’asse mediano verso la coda, sollevare la pelle al centro del collo usando una pinza e tagliare la pelle verso entrambe le ascelle con le forbici.

Quindi tagliare la pelle dall’ombelico alle gambe. Dopo aver incorporato i campioni, regolare la posizione della proiezione laser al centro del campione sullo schermo e regolare la manopola dello zoom su 20x. Per ottimizzare la risoluzione, impostare il guadagno su 1.250V.

Ingrandire l’area blu utilizzando la manopola di messa a fuoco, quindi ripristinare il guadagno a circa 750 V per l’imaging. Quindi, passare il metodo di taglio su automatico. Impostare lo spessore a circa 50 micrometri ed eseguire le diapositive.

Smettere di tagliare quando i polmoni e le vie aeree sono in vista. Scegli uno spessore di taglio compreso tra otto e 10 micrometri e interrompi l’apertura della vista dal vivo. Aprire Microtome Communicator per avviare l’imaging.

Assicurarsi che la cartella di archiviazione temporanea sia vuota prima di raccogliere le immagini. Interrompere la raccolta di immagini quando non è visibile alcuna struttura rigida. Output dei file archiviati temporanei in un’unica serie di immagini TIFF.

Per la ricostruzione delle immagini 3D, trascinare e rilasciare i file di immagine nel software di elaborazione delle immagini. Una volta visualizzata la finestra pop-up, selezionare i collegamenti o i file da copiare nel database. Una volta aperto il file, fare clic sul menu Strumenti di ricostruzione 3D 2D dalla barra degli strumenti e selezionare MPR 3D.

Per la risoluzione pixel X e la risoluzione pixel Y, inserisci la risoluzione dell’immagine fornendo lo zoom utilizzato durante l’imaging ECM. Per l’intervallo di sezione, immettere lo spessore della fetta utilizzato per tagliare durante l’imaging ECM. Quindi, utilizzare lo strumento WWWL per regolare la larghezza e il livello della finestra.

Fare clic e trascinare lo strumento sull’immagine verso l’alto per ridurre la luminosità dell’immagine e verso il basso per aumentarla. Fai clic e trascina lo strumento sull’immagine verso destra per ridurre il contrasto dell’immagine e la parola sinistra per aumentarlo. Trascinate le immagini nelle posizioni desiderate utilizzando lo strumento panoramica.

Utilizzare lo strumento zoom per ingrandire o ridurre l’immagine e lo strumento rotazione per ruotare l’immagine come desiderato. Ora, fai clic e trascina l’asse colorato del primo pannello. Notate come ruotando questo asse cambia l’orientamento degli altri due pannelli.

Ruotate gli assi dei tre pannelli fino a quando i tre pannelli non rappresentano le viste coronale, sagittale e trasversale del campione. Una volta che tutti e tre i pannelli sono opportunamente posizionati, orientati e illuminati, fare clic sul pannello che rappresenta la vista coronale. Quindi fare clic su Esportazione film sul lato destro della barra dei menu.

Fai clic su batch e trascina i cursori da e a per comprendere l’intera regione di interesse. Per l’intervallo, selezionate l’opzione uguale allo spessore e salvate il video indicando l’orientamento delle viste. L’eco mostra un setto ventricolare intatto senza uno shunt intraventricolare e grandi arterie normali correlate nel controllo normale, che è stato confermato dalla ECM.

La vista frontale dimostra la comunicazione tra LA, RA, LV e RV sia nell’eco che nell’ECM, suggerendo un difetto del setto atrioventricolare. Il flusso di colore dimostra il flusso attraverso LV e RV indicando un difetto del setto ventricolare. Echo ed ECM hanno dimostrato una doppia uscita del ventricolo destro con un difetto del setto ventricolare tra LV e RV con grandi arterie affiancate.

La diagnosi ecografica del tronco arterioso persistente dimostra la comunicazione tra LV e RV con un singolo tratto di efflusso che sovrascrive entrambi i ventricoli, confermata anche dalla ECM allo stadio E14.5. Le sezioni raccolte dall’istologia ECM possono essere ulteriormente elaborate per l’immunocolorazione, la colorazione dell’ematossilina e dell’eosina e persino l’estrazione dell’acido nucleico per la genotipizzazione e il profilo trascrizionale o l’estrazione di proteine per l’analisi proteomica. Le immagini della ricostruzione tridimensionale possono essere ulteriormente elaborate per valutazioni di perimetri quantitativi come area o volume.

La fenotipizzazione accurata per identificare i difetti nell’anatomia cardiovascolare è essenziale per stabilire modelli murini geneticamente modificati e mutanti di cardiopatia congenita per chiarire i meccanismi patologici della cardiopatia congenita. Ciò può portare a potenziali opportunità che sviluppano terapie e interventi per migliorare l’esito clinico nei pazienti con cardiopatia congenita.