בדיקת חסמים פיזיולוגיים להעברת נגיפי ב כנימות שימוש Microinjection
14 במאי 2008
כנימות הם משדרים יעיל של וירוסים הצמח. Microinjection כנימה של הנגיף, ההליך נוכל להראות לכם היום, היא טכניקה המאפשרת לחוקרים להזרים וירוס ישירות hemocoel של הכנימה, לעקוף את המעיים, אחד 2 המחסומים העיקריים להעברת הנגיף באופן circulative. באותה טכניקה משמשת גם להזריק dsRNA עבור RNAi.
אם הן משמשות כמנחלי וירוסים של צמחים יעילים, ובמידה ומדובר בהזרקה זעירה של וירוס, הפרוצדורה שנגלה לכם היום היא טכניקה המאפשרת לחוקרים להזריק וירוס ישירות לתאי ההמוlyמפה (hemos cell) של ה-AFib, ובכך לעקוף את מערכת העיכול, אחד משני המחסומים העיקריים להעברת וירוסים באופן מחזורי. שלום, אני ססיליה טמרין דהי, פוסט-דוקטורנטית במחלקה לפתולוגיה של צמחים באוניברסיטת קורנל. היום אראה לכם כיצד להזריק וירוס לתאי ההמוlyמפה של ה-AFI, וירוס שניתן לאחר מכן להנחילו למיני צמחים שונים.
לדוגמה, צמח FE זה נגוע ב-PLRV, נגיף העלה של תפוח האדמה. ניתן לראות את ההבדל בין צמח בריא לצמח נגוע. התסמין הבולט ביותר הוא סקלרוזיס של הגבעול.
PLRV הוא נגיף מסוג luthier המועבר על ידי APHIS בלימפה של החרק (hemolymph), המקבילה לדם ביונקים. כאשר APHIS שאינו נגוע ניזון מצמח נגוע, הוא נדבק בנגיף דרך נוזלי הצמח, כפי שניתן לראות כאן. לאחר הבליעה, הנגיף חייב לעבור ממערכת העיכול של החרק אל הלימפה, ולאחר מכן לעבור דרך בלוטות הרוק כדי שיועבר חזרה לצמח ה-ESE.
ואם כי כך עשויים להיקלט וירוסים רבים בעת התזינות מצמח ESE, עם זאת, רק חלק קטן יותר יעבור דרך מערכת העיכול ובלוטת הרוק. אלו הם שני המחסומים העיקריים להעברה לצורך הדבקת צמחים נוספים לבדיקה. אם ה-AFI אינו מסוגל להוות וקטור לווירוס, אנו מאכילים את הכנימות ברקמה נגועה למשך יומיים, ולאחר מכן אנו מאפשרים להן להזין בצמח בריא למשך חמישה ימים.
לאחר מכן מעשנים את הצמח, ולאחר שלושה שבועות אנו מתחילים לחפש תסמינים. כאשר אנו מוצאים AFib שאינו מסוגל להעביר את הנגיף כווקטור, אנו יכולים להעריך איזה מהשני המחסומים עוצר את הנגיף באמצעות הליך מיקרו-הזרקה, אותו אראה לכם היום. בהליך זה, הנגיף מוזרק ישירות לתוך תאי ההמולימפה שם, ובכך עוקפים את מחסום ההעברה במעי.
אם כך, נתחיל, ואני אראה לכם כיצד לבצע מיקרו-הזרקה לחלקים של apex. אלו הן מחטי הזכוכית שבהן אנו משתמשים. אנו מושכים מחטי זכוכית ממגני זכוכית אלו באמצעות APU.
זהו המיקרו-מזרק. לביצוע מיקרו-הזרקה של וירוס, אני אתחיל להכניס את המחט למחזיק המחטים.
כעת אני פשוט מכניס את המחט וממקם אותה. עכשיו אטען את הנגיף לתוך המחט עד לקצה העליון של המזרק. כעת עלינו למקם את ה-AFI להזרקה מיקרוסקופית.
כעת אני אקח כנימה (AFI) עם לחץ כאב ואני אניח אותה במחזיק הכנימות. באופן אידיאלי, אנסה להניח את גב הכנימה כנגד המחזיק כדי שתהיה לי גישה לחלק הבטני של הכנימה. אוקיי, מצוין.
כעת ניתן להמשיך להזרקה מיקרוסקופית. אקבע כעת את מיקום המחט ואקרב אותה אל ה-AFib. כעת אבצע מגע בין המחט ל-AFib, וכדי לנקב את השלד החיצוני, הדבר הנכון ביותר הוא לנסות לנקב בין הסגמנטים בבסיס הרגליים.
כעת אבצע את ההזרקה. אני לוקח את ה-AFI באמצעות המברשת ומעביר אותו אל נייר ההשחזור, שם אשאיר אותו להתאושש לרגע. עלינו לבצע גם הזרקה מיקרוסקופית של AFI ביקורת.
הזרקה זעירה (micro injection) של ביקורת זו מבוצעת עם התמיסוף בלבד, ללא הווירוס. התמיסוף שבו אנו משתמשים הוא phosphate buffer בריכוז 0.1 וב-pH 7. אני אמקם את ה-A fit בצמח בריא, שבו אאפשר לו להתבסס למשך חמישה ימים, לאחר מכן אטפל בצמח ואמתין להופעת סימפטומים. לאחר ההזרקה הזעירה של ה-NA בעלי הגדיל התחתון, במהלך שבוע, נמדוד בכל יום את רמת הביטוי של הגן המטרה ב-afi.
בצענו כעת מיקרו-הזרקה לכינקס שלא היה מסוגל להעביר את הנגיף. אם לאחר המיקרו-הזרקה הכינקס יהיה מסוגל להעביר את הנגיף, המשמעות היא שלכינקס זה היה מחסום במעי שחסם את הנגיף. מאידך, אם לא יתפתחו תסמינים, המשמעות היא שלכינקס זה יש מחסום חזק בבלוטות הרוק.
כך הצגנו כיצד לבצע מזריקה מיקרוסקופית של נגיפים לתוך הכנימות. אותו הליך משמש להזרקה מיקרוסקופית של RNA גדילי לתוך הכנימות לצורך ביצוע RNAi (השתקה גנטית), שהיא טכניקה מעניינת המסייעת בחקר תפקוד גנים בכנימות. זהו כל התהליך של ההזרקה המיקרוסקופית.
אני מקווה שתיהנו מכך ושהדבר יעזור לכם בניסוייכם. תודה רבה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כינמות משמשות כמפיצות יעילות של נגיפי צמחים. מאמר זה מדגים טכניקת מיקרו-הזרקה המאפשרת לחוקרים להזריק נגיפים ישירות להמול (hemocoel) של הכינמות, ובכך לעקוף את המעי, המהווה מחסום משמעותי להעברת הנגיף.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- פתולוגיה של צמחים
- וירולוגיה
- אנטומולוגיה
רקע
- כינימנים ידועים כווקטורים לווירוסים שונים של צמחים.
- הבנת מנגנוני העברת הנגיפים חיונית לבריאות הצמח.
- טכניקות של מיקרו-הזרקה יכולות לשפר את המחקר על אינטראקציות בין נגיף למארח.
- הזרקה ישירה להמוקול (hemocoel) עוקפת מחסומים עיכוליים.
מטרת המחקר
- להדגמת טכניקת המיקרו-הזרקה להחדרת נגיפים בכיני קישוטים.
- להקל על חקר העברת נגיפים לצמחים.
- לספק תובנות לגבי ההשפעות של נגיפים ספציפיים על בריאות הצמח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקה מיקרוסקופית של נגיף לחלל ההמולימפה (hemocoel) של כנימות.
- מעקב אחר העברת הנגיף לצמחים מאחים.
- השוואה בין צמחים נגועים לצמחים בריאים.
- תיעוד של תסמינים הקשורים לזיהומים נגיפיים.
תוצאות עיקריות
- הושגה הזרקה מוצלחת של וירוסים לתוך קישריים.
- צמחים נגועים הראו תסמינים בולטים, כגון סקלרוזיס של הגבעול.
- הטכניקה מאפשרת מחקר ישיר של השפעות הווירוס על צמחים.
- הוכשר הפוטנציאל של קישריים להעביר וירוסים ביעילות.
מסקנות
- טכניקת המיקרו-הזרקה היא כלי בעל ערך לחקר נגיפי צמחים.
- ניתן להשתמש בכנימות כדי למדל את דינמיקת העברת הנגיף.
- מחקרים נוספים יכולים לבחון את ההשלכות על בריאות היבולים וניהולם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח מחסומים פיזיולוגיים להעברה ויראלית בכנימות באמצעות מיקרו-הזרקה מאפשר תיקוף מדויק של מטרות בבדיקת כשירות הווקטור במודלים של פתוגנים חקלאיים. גישה זו שופכת אור על צווארי בקבוק מכניסטיים במעבר הווירוס, ובכך תומכת בביטחון חיזוי עבור מחקרים תרגומיים בפתולוגיה של צמחים ובביולוגיה של וקטורים. השיטה מספקת בסיס לקבלת החלטות מותאמות סיכונים עבור אסטרטגיות פיתוח המכוונות לצמצום מחלות המועברות על ידי וקטורים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של מחסומי המעי ובלוטות הרוק במחקרי כשירות וקטורית.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד נקודות בקרה פיזיולוגיות במעבר נגיפים.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות מועמדות המשפיעות על מעבר פתוגנים בווקטורים מדגים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מודלים מאומתים של חרקים לסריקה המשכית של התערבויות לחסימת העברה ויראלית.
- מנרמל את המיקרו-הזרקה כבדיקה הניתנת לשחזור לניתוח תפקוד מחסומים.
- מייצר פלטיים כמותיים על הצלחת ההעברה לאחר עקיפת מחסום.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים של כשירות וקטורים לתרחישי העברה רלוונטיים למחלות בקווי ייצור של הגנת גידולים.
- מאפשרת רציפות מגילוי מכניסטי ועד לתיקוף פרה-קליני של אסטרטגיות המכוונות לווקטורים.
- תומכת בהפחתת סיכונים חזויה עבור מחקר תרגומי באפידמיולוגיה של וירוסי צמחים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
שיטה זו של מיקרו-הזרקה משולבת בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים לאימות פרה-קליני בתהליכי עבודה של ביולוגיה של וקטורים ופתולוגיה של צמחים.
- ביולוגיה של גילוי: מבהירה נקודות בקרה פיזיולוגיות בכשירות הווקטור, ובכך תומכת בתיקוף מטרות מבוסס היפותזה.
- סריקה: מספקת בדיקה סטנדרטית להערכת תפקודי מחסום ויעילות התערבות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות כמותיות על העברה ויראלית לאחר מיקרו-הזרקה לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאים מכניסטיים למודלים פרה-קליניים של העברת מחלות המועברות על ידי וקטורים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לניתוח מחסומי העברה במערכות שונות של וקטור-פתוגן.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ביכולת הווקטורית ובאסטרטגיות לחסימת ההעברה.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בדיקות מעקף מחסומים לצורך הדירות וניתנות להרחבה בשרשראות מחקר ופיתוח.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשך או עצירה (go/no-go) עבור התערבויות המכוונות לווקטורים והקצאת משאבים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של יעדי ווקטור-פתוגן לצורך קידום טרנסלציוני.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות טכנית במיקרו-הזרקה וטיפול בחרקים.
- נדרש מיכשור מיקרו-הזרקה ייעודי ומערכות בופר מתוקתקות.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך הדירות הבדיקה והשוואת נתונים.
- עשוי לדרוש התאמה עבור מיני קישואנים שונים או שילובים שונים של וקטור-פתוגן.
- מוגבל לניתוח מחסומים פיזיולוגיים; אינו עוסק במשתנים אקולוגיים או משתנים ברמת השטח במורד הזרם.
