Neurocircuit Assays für Anfällen bei Epilepsie Mutanten Drosophila

Biology

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Summary

Mit hochfrequenten elektrischen Stimulation, Beschlagnahme-ähnliche Aktivität kann in induziert werden

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Howlett, I. C., Tanouye, M. A. Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila. J. Vis. Exp. (26), e1121, doi:10.3791/1121 (2009).

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Abstract

Drosophila melanogaster ist ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der Beschlagnahme ähnliche Aktivität. Eine Vielzahl von Mutanten, bei denen Anfälle entweder durch Erschütterungen oder elektrische Stimulation induziert werden kann, ist verfügbar für das Studium der verschiedenen Aspekte der Beschlagnahme Aktivität und Verhalten. Alle Fliegen, einschließlich Wild-Typ wird zu unterziehen Beschlagnahme-ähnliche Aktivität, wenn bei einer ausreichend hohen Spannung angeregt. Beschlagnahme ähnliche Aktivität ist eine Alles-oder-Nichts-Reaktion und jeden Genotyp hat eine spezifische Krampfschwelle. Die Beschlagnahme Schwelle zu einem bestimmten Genotyp fliegen kann entweder durch Behandlung mit einem Medikament oder durch genetische Verdrängung oder Verbesserung verändert werden. Die Schwelle ist leicht von der Elektrophysiologie gemessen. Beschlagnahme-ähnliche Aktivität kann über hochfrequente elektrische Stimulation direkt an das Gehirn geliefert und erfasst durch die dorsale Längsmuskeln (DLMS) in den Thorax induziert werden. Die DLMS sind Teil der riesigen Faser-System innerviert. Beginnend mit niedriger Spannung, Hochfrequenz-Stimulation, und anschließend Erhöhung der Spannung in kleinen Schritten kann die Krampfschwelle für eine Fliege gemessen werden.

Protocol

Probenvorbereitung:

Die Nacht vor dem Versuch werden männliche Fliegen der gewünschten Genotyp betäubt und in ein Fläschchen mit einem weichen Nylon-Stecker. Ein Wattebausch würde auch funktionieren. Nach Betäubung, die Krampfschwelle verändert wird, so die Fliegen am besten für mindestens 6 Stunden nach links, wenn über Nacht ideal ist.

Am Tag des Experiments, die Fliegen ein zu einer Zeit auf Glasträger montiert mit einer Schicht aus Dentalwachs auf einer Seite.

Eine einzige Fliege wird durch den Kopf mit einer 23-Gauge-Nadel (mit der scharfen Spitze abgeschnitten), die an eine Saugleitung abgeholt.

Die Fliege wird dann das Wachs auf der Folie, indem Sie die Beine und Flügel in das Wachs befestigt.

Nachdem die Fliege immobilisiert ist, ist das Wachs bis um den Hals geschoben und die Augen voll Immobilisierung des Kopfes.

Elektrophysiologie:

Die Fliege, die nun montiert und bereit zu gehen ist in der Elektrophysiologie platziert eingerichtet.

Die Elektrophysiologie Einrichtung besteht aus drei Sets von Mikromanipulatoren, die jeweils mit 1-2 geschärft Wolfram Elektroden angebracht. Die Spannung wird durch einen Stimulator, die zu einer Isolierstation an der stimulierenden Elektroden verbunden ist. Die Aufnahme-Elektrode ist mit einem Vorverstärker, was wiederum zu einem digitalen Speicher-Oszilloskop angeschlossen ist. Während es nicht wesentlich ist, ist es sinnvoll, einen Lautsprecher bis an das Oszilloskop so, dass die Antworten hörbar gemacht werden können süchtig sind.

Eine Masseelektrode ist in den Bauch der Fliege eingesetzt.

Die Aufnahme Elektrode wird in einer der Dorsal Längsmuskeln in den Brustkorb der Fliege eingesetzt.

Die stimulierenden Elektroden werden in den Kopf gesteckt. Ein an der Seite jedes Auges.

Der Stimulator sollte die folgenden Einstellungen zu starten: Continuous Pulsabstand mit 2 Sekunden zwischen jedem Impuls. Es sollte kein Puls zu verzögern. Die Impulsbreite sollte 0,2 ms.

Das Oszilloskop sollte die Speicherung Funktion eingeschaltet haben und die folgenden Einstellungen: Time / DIV sollte 1ms/DIV eingestellt werden. Der Volt / DIV sollte entweder 0.1V/DIV oder 50 mV / DIV eingestellt werden.

Der Riese Faser Schwelle ist durch die Bereitstellung einzelner Impulse und in Anbetracht der minimalen Spannung benötigt, um eine Antwort zu bekommen bestimmt. Diese Spannung ist in der Regel etwa 2 V.

Nach dem riesigen Faser Schwelle ermittelt wurde, zu stoppen pulsierende the fly und ändern Sie die Einstellungen auf dem Oszilloskop: 0,2 s / div

Die Einstellungen auf der Stimulator sollte geändert werden: Der Puls-Intervall sollte auf einzelne eingestellt werden. Der Zug sollte eingeschaltet sein und auf 3 Sekunden. Die Wellenform Parameter sind: 0,5 ms Pulse bei 200Hz für 300 ms. Die Spannung wird auf die gewünschte Einstellung und ein Hochfrequenz-Impulsfolge ist die Fliege das Gehirn geliefert geändert.

Wenn ein Anfall nicht induziert wird, wird die Oszilloskopspur zeigen eine flache Linie, nachdem der Zug. Wenn die Einstellungen schnell eingestellt sind zurück zum Ausgangspunkt Einstellungen, werden die einzelnen Impulse zu einer Reaktion in der riesigen Faser-System.

Wenn ein Anfall induziert wird, wird das Oszilloskop die Beschlagnahme-ähnliche Aktivität, nachdem der Zug zu zeigen. Wenn die Einstellungen schnell wieder auf die ursprünglichen Einstellungen eingeschaltet, werden die einzelnen Pulse nicht um eine Antwort in den riesigen Faser-System zu aktivieren.

Die Fliegen haben eine Refraktärzeit nach einem hochfrequenten Stimulus Wellenzug in dem die Beschlagnahme ähnliche Aktivität nicht zu induziert. Wenn kein Anfall die Fliegen sind für etwa 7 Minuten feuerfest. Wenn ein Anfall induziert wird, haben die Fliegen eine Refraktärzeit von ca. 17 Minuten.

Bei der Festlegung der Schwellenwerte, können zusätzliche hochfrequente Impulse für den gleichen Flug (nach dem geeigneten Zeitpunkt für die Refraktärzeit) geliefert werden, bis der Schwellenwert ermittelt wird oder bis der Riese Faser Reaktion zu schwach, um zu sehen.

Nach dem Experiment abgeschlossen ist, wird die Fliege von der Elektrophysiologie entfernt einzurichten, veröffentlicht von der Wachs-und entsorgt.

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Discussion

Dieses Video wurde die grundlegenden Schritte bei der Bestimmung der Krampfschwelle einer einzelnen Fliege Drosophila demonstriert. Anstelle der Verwendung der digitalen Oszilloskop kann ein EDV-Digitizer verwendet werden. Diese Technik ist nützlich für die Bestimmung der Wirkung eines Arzneimittels oder genetische Veränderung auf die Krampfschwelle einer Fliege.

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Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch ein NIH Forschungsstipendium, eine Epilepsie-Stiftung zu gewähren und eine McKnight Foundation gewähren MT Experimente an Drosophila Fruchtfliege wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der UC Berkeley Tierversuchen eingesetzten Ausschusses durchgeführt unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital oscilloscope Hitachi VC-6523
Stimulator Cornerstone S-900
Preamplifier World Precision Instruments, Inc. Electro 705
Micromanipulators Narishige International various

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References

  1. Kuebler, D., Tanouye, M. A. Modifications of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 83, 998-1009 (2000).
  2. Kuebler, D., Zhang, H., Ren, X., Tanouye, M. A. Genetic suppression of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 86, 1211-1225 (2001).
  3. Song, J., Tanouye, M. A. Seizure suppression by shakB2, a gap junction mutation in Drosophila. J Neurophysiol. 95, 627-635 (2006).

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