Microarray 실험에 대한 Gibberella zeae Ascospore 생산 및 수집.

Published 11/30/2006
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Biology

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Summary

무균 조건 하에서 Gibberella zeae, 수집을위한 절차에 ascospores의 발달 과정을 공부를하는 것은 프로토콜에 대한 정보의 최고 수준을 생성하기 위해 촬영입니다. 이것은 실험, 전체 게놈 표현 프로필 테스트 구현하는 중요한 부분의 재현성을 촉진한다.

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Pasquali, M., Kistler, C. Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.. J. Vis. Exp. (1), e115, doi:10.3791/115 (2006).

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Abstract

Fusarium graminearum 슈왑 (teleomorph Gibberella zeae)은 밀가루와 작물 생산량과 곡물의 품질을 감소 보리에 딱지가 질병을 일으키는 식물 병원균이다. F. graminearum 또한 옥수수의 줄기와 귀를 썩게하는 원인과 같은 곡물을 오염과 인간과 가축 (Goswami 및 키슬러, 2004)에 유해한하는 trichothecenes로 mycotoxins의 생산이다. 곰팡이는 포자의 두 종류를 생산하고 있습니다. Ascospores, 성적 재생산으로 인한 propagules는 주요 감염의 주요 원천입니다. 이들 포자는 강제 성숙 perithecia에서 배출되는 바람 (Francl 외 1999)에 의해 분산됩니다. 이차 감염은 주로 식물의 표면에 성별이없는 방법으로 생산 macroconidia로 인해 발생합니다. 이 균류에 ascospores의 발달 과정을 연구하기 위해 무균 조건 하에서 대량의 그들의 수집에 대한 절차가 필요했습니다. 전체 게놈의 유전자 발현 프로파일을 생성하고 해석하는 경우 중요한 측면, 우리 프로토콜은 이해와 재현성에 대한 정보의 최고 수준을 생성하기 위해 촬영되었습니다. 특히, ascospore 발아 및 생물 학적 활동의 변화는 물질의 사전 처리에 의존하고 있습니다. ascospore 생산의 모든 단계를 문서화를위한 비디오의 사용 microarray 분석을 위해 점점 더 엄격한 요구 사항 준수, 표준화를 향상시키기 위해 제안합니다. 절차는 표준 실험실 장비가 필요합니다. 단계는 오염 및 ascospores 찬성 시간 동기화를 방지하기 위해 표시됩니다.

Protocol

  1. 캐롯 한천은 (Klittich와 레슬리, 1988) 9 cm 직경 배양 접시에 준비되었다.
  2. 덱스 트로 오스 감자 한천 배지에서 성장 신선한 균사체를 포함하는 한천의 2mm 큐브는 각 페트리 접시의 중심에 적용되었다.
  3. 문화가 25 성장했다 ° C와 96 시간을위한 12 - H photoperiod.
  4. 수성 2.5 % 트윈 60 하나 ML은 부드럽게 눌러, 플라스틱 막대와 문화의 표면 (트레일 및 커먼, 2000)에 적용하고 문화에 걸쳐 확산되었다.
  5. 같은 photoperiod 25 ° C에서 높은 습도 환경에서 보관하면 Perithecia 촬영이 유도 치료 후 7-10 일 개발 ascospores.
  6. 포자 수집 perithecia가 어둠 속에서 제한된 시간 (예 : 12 시간)을 위해 촬영을 떠나, 페트리 접시의 뚜껑을 변경하여 수행됩니다.
  7. 멸균 물을 부드럽게 표면에 물을 이동하여 ascospores를 보류, 뚜껑에 추가됩니다.
  8. Ascospores는 무균 팰컨 튜브에 수집 세탁 및 추가 분석을 위해 사용됩니다.

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Discussion

여기에 제시 프로토콜은 Fusarium 종에 대한 perithecial 생산에 사용되는 이전 절차에 따라 달라집니다. (Klittich와 레슬리, 1988, 트레일 및 커먼, 2000). ascospores 다량의 (microarray 분석을위한 충분한)가 생성되었습니다하는 절차의 표준화는 실험의 재현성을위한 필수했다. 이것은 환경 요인, 나이, 기판 차이가 ascospores의 생물 학적 특성 (베여 및 Verreet, 2005)를 변경할 수보고되었습니다. 따라서 동영상의 사용은 재현성을 촉진한다 포자 생산하고 수집하는 방법으로 작은 세부 사항을 강조 표시될 수도 있습니다. 특히 프로 시저의 비디오 실험실 간의 표준화의 수준을 향상시키고 ascospore 생산을 필요로 전체 게놈 해독 연구의 비교를 용이하게한다. 페트리 접시의 많은 수의 동기적으로 처리되어야하므로 실험 절차에 필요한 RNA의 양은 상대적으로 높습니다. 그것이 이후의 실험에 대한 표준을 설정, 새로운 생물 학적 물질에 대한 전체 게놈 transcriptional 공부를 구현하기 위해 필요한 경우 비디오 특히 적합한 도구입니다.

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Acknowledgements

저자는 훌륭한 기술 지원 카렌 힐번 감사합니다. 이 프로젝트는 USDA 협동 상태 연구, 교육 및 연장 서비스 (수상 # 2004-35604-14327)의 국립 연구 이니셔티브에 의해 지원되었다. 마띠아스 Pasquali는 브랑코 와이즈 원정대에 의해 지원됩니다. 미국 밀과 보리의 스켑 이니셔티브는 연구의 지속적인 지원을 인정받고 있습니다.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Petri dish 9 cm diameter Tool
Tween 60 (20%) Reagent
Carrot agar (20% w/v organic carrots and 1.5% w/v agar) Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beyer, M., Verreet, J. A. Germination of Gibberella zeae ascospores as affected by age of spores after discharge and environmental factors. (2005).
  2. Francl, L., Shaner, G., Bergstrom, G., Gilbert, J., Pedersen, W., Dill-Macky, R., Sweets, L., Corwin, B., Jin, Y., Gallenberg, D., Wiersma, J. Daily inoculum levels of Gibberella zeae on wheat spikes. Plant Disease 83,662-666. (1999).
  3. Goswami, R. S., Kistler, H. C. Heading for disaster, Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology 5,515–525. (2004).
  4. Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants in Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi. Genetics. 118, 417-2013 (1998).
  5. Trail, F., Common, R. Perithecium development in Gibberella zeae, a light microscopy study. (2000).
  6. Tschantz, A. T., Horst, R. L., Nelson, P. E. A substrate for uniform production of perithecia in Gibberella zeae. Mycologia. 67-1101 (1975).
  7. Tschanz, A. T., Horst, R. K., Nelson, P. E. The effect of environment on sexual reproduction of Gibberella zeae. (1976).

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