Nuclear Transfer in Maus-Oozyten

Biology

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Summary

Dieser Film und das Protokoll sollen helfen, das Lernen Kerntransfer.

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Egli, D., Eggan, K. Nuclear Transfer into Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (1), e116, doi:10.3791/116 (2006).

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Abstract

Nuclear Transfer in eine unbefruchtete Eizelle kann Entwicklungspotenzial zu einer differenzierten Zelle wiederherzustellen. Dies zeigt, dass die zugrunde liegenden Prozesse Entwicklung, Differenzierung und Alterung epigenetische anstatt genetische Prozesse sind. Die Reversibilität dieser Prozesse eröffnet spannende Perspektiven in Grundlagenforschung und in der ferneren Zukunft, in der regenerativen Medizin. In der Maus können embryonale Stammzellen aus geklonten Embryonen Präimplantationsstadium abgeleitet werden. Solche embryonalen Stammzellen haben die Fähigkeit, sich zu allen Zelltypen des erwachsenen Organismus zu geben. Wichtig ist, dass diese Zellen genetisch identisch mit dem Spender. Wenn für Menschen, würde dies ermöglichen die Gewinnung von Stammzellen aus einem Patienten. Diese Zellen könnten dann in das betroffene Zelltyp des Patienten differenziert werden und studiert in vitro oder verwendet werden, um die beschädigte oder fehlende Zellen zu ersetzen. Das Studium der Kerntransfer bei der Maus bleibt wichtig, da sie uns über die Prinzipien der nuklearen Umprogrammierung informieren können. Dieser Film und die begleitenden Protokoll sollen helfen Lernen Kerntransfer bei der Maus, eine Methode, zunächst in der Arbeitsgruppe von Prof. Yanagimachi (Wakayama et al. 1998) entwickelt.

Protocol

Vorbereitungen:

  1. Eine detaillierte Beschreibung der Superovulation und microdrop Embryokultur kann an anderer Stelle 2 zu entnehmen.
  2. Bereiten Sie eine Petrischale mit Mikrotropfen der Embryo Kulturmedium (zB KSOM, Chemicon). Deckel mit Mineralöl (Erdöl Chargen sollten für die Kompatibilität mit Embryokultur getestet werden). Äquilibrieren bei 37 ° C in Luft plus 5% CO 2. (In Thermo-Electron 3110 Wassermantel Inkubator oder gleichwertig)
  3. Bereiten Sie eine Schüssel für die Isolierung von Oozyten: Place Tropfen Hepes gepuffert CZB & Hyaluronidase (0,1% w / v, Sigma) in einer Hälfte des Tellers und HCZB in der anderen Hälfte. Deckel mit Mineralöl. Halten Sie die Schale warm auf einem beheizten Bühne eines Dissektionsmikroskop.
  4. Bereiten Sie das Mikroskop: Legen Sie eine Haltepipette aus einem äußeren Durchmesser von etwa 50 μ m (etwas kleiner als der Durchmesser der Eizelle) und eine Öffnung von ca. 20 μ m in einem Pipettenhalter. Halten Pipetten sind einfach, mit der erforderlichen Ausstattung, eine Nadel Puller (Sutter Instruments) und einem microforge (Narishige) machen, aber sie können auch aus Humagen erworben werden.

    Legen Sie 3-5 μ l Quecksilber in den Schwanz einer Mikropipette (Innendurchmesser 8 μ m). Vermeiden Sie Quecksilberleckagen. Bereiten Sie einen Teller mit mehreren kleinen Tropfen je 11% w / v PVP (Polyvinylpyrrolidon) in HCZB und 5 μ g / ml Cytochalasin B in HCZB. Verwenden Sie den Deckel einer Petrischale, anstatt das Gericht selbst als Deckel hat einen kurzen Felge, die nicht mit der Bewegung des Betriebes und der Enukleation Pipetten wird beeinträchtigt. Richten Sie die Haltepipette und die Enukleation Pipette in einem HCZB fallen. Saugen Sie ein wenig HZCB in die Spitze des Haltepipette.
  5. Vorbereitung von Spender-Zellen hängt weitgehend von der Zellart und dem Experiment der Forscher will durchführen. Im Allgemeinen sollten Spenderzellen mit einem proteolytischen Enzym wie Trypsin behandelt und auf Eis gehalten, um Klebrigkeit bis zum Transfer zu reduzieren.
  6. Human einschläfern Mäuse 14-15 Stunden nach der Verabreichung von hCG. Ernte Eileiter und sezieren sie in den warmen HCZB-Hyaluronidase Tropfen. Nach ca.. 5 min, wird Eizellen werden vor allem frei von Cumulus-Zellen. Sie sollten dann mehrere Male in HCZB gewaschen werden, dann weiter in die voräquilibriert KSOM Tropfen gewaschen, und hielt in den Inkubator bis Enukleation.

Enukleation

Manipulationen sind mit hydraulischen Mikromanipulatoren, (Narishige) auf einem inversen Mikroskop, wie die Nikon TE200 getan. Ein Piezo-Mikromanipulator (Primetech) ist für das Bohren der Zona pellucida verwendet. Flat-Spitze Enukleation und Transferpipetten aus Humagen erworben werden. Reinigen und schmieren Sie die Enukleation Pipette in die PVP Tropfen durch die Vertreibung mikroskopischen Quecksilbertröpfchen und durch Absaugen und Vertreibung PVP. Um zu verhindern, Klebrigkeit der Nadel, sollte das gleiche Verfahren zwischen den einzelnen Gruppen von Eizellen, die entweder entkernt werden oder übertragen getan werden.

Legen Sie eine kleine Gruppe von Eizellen in den HCZB-Cytochalasin B fallen. Die Größe der Gruppe sollte auf der Ebene der Erfahrung des Untersuchers angepasst werden. Eizellen sollten nicht auf der Bühne nicht länger als 20-30 min gehalten werden. Bewegen Sie die Instrumente, um die HCZB-Cytochalasin B fällt. Die Holding Pipette und der Enukleation Pipette sollte in Einklang mit der Äquatorebene der Eizelle gebracht werden. Dies wird möglich, wenn die Haltepipette hat einen Außendurchmesser, der geringfügig kleiner als die Eizelle selbst ist. Drehen Sie eine Eizelle bis zum unterschiedlich refraktiven Metaphase Spindel zu sehen. Wenn ein Anfänger nicht sehen können, die Spindel, die Metaphaseplatte identifiziert mit dem DNA-Farbstoff Hoechst und UV-Beleuchtung jedoch, dass nicht kompatibel ist mit effizienten Embryonalentwicklung werden. Position der Metaphase Spindel bei 3 Uhr und halten Sie sie gut mit dem Haltepipette. Bewerben Piezo-Impulse an die Zona pellucida zu durchdringen. Berühren Sie die Metaphase-Platte mit der Enukleation Pipette. Sobald der Widerstand der Metaphase Spindel "gefühlt" werden können, absaugen die Spindel und ziehen Sie die Nadel. Die Eizelle Zytoplasma ist fließend, der Metaphase Spindel jedoch bewegt sich wie ein Klumpen, wenn sie mit der Pipette berührt. Versuchen Sie, den Betrag von Zytoplasma, die mit der Spindel entfernt zu reduzieren. Nachdem eine Gruppe von Oozyten wurden entkernt wurde, waschen Sie sie durch Embryo Kulturmedium und legen Sie sie in den Brutschrank bis zum Transfer. Einige entkernte Eizellen dürfen nicht übertragen werden, sollten aber aktiviert werden und dienen als Kontrolle für Enukleation. Diese Eizellen werden Fragment innerhalb von mehreren Stunden, was eine erfolgreiche Enukleation.

Nuclear Transfer

Legen Sie Zellen in PVP-Lösung (11% PVP in HCZB). Wenn viele Klone Verhaftung an der 1-Zell-Stadium, sollte der PVP-Konzentration auf 5% oder weniger gesenkt werden. Mix-Zellen auch with PVP. Pick-up-Zellen mit einer Pipette mit einem inneren Durchmesser, der geringfügig kleiner als der Durchmesser der Zelle. Die Membran der Zelle soll auf Bestreben zu brechen. In einigen Fällen können wiederholte Vertreibung und Aspiration sowie die Anwendung der sanften Piezo-Impulse verwendet, um die Donor-Zelle zu brechen. Ein neuer Tropfen Spenderzellen sollte mit jeder Gruppe von Eizellen übertragen werden, wie Spenderzellen nach einiger Zeit klebrig. Spritzen Sie die gebrochenen Donorzelle kurz nach dem Bruch der Membran. Für die Übertragung auf die Äquatorialebene der Eizelle selbst und nicht die Äquatorialebene der Zona pellucida zu konzentrieren, und positionieren Sie den Transfer und die Haltepipette in der gleichen Ebene. Halten Sie die Eizelle auch einen Teil seiner Zytoplasma fest. Dringen in die Zona pellucida mit Piezo-Impulse. Bringen Sie den Spender Kern an der Spitze der Pipette, dann drücken Sie die Pipettenspitze fast auf der gegenüberliegenden Seite der entkernten Eizelle, in der Nähe des Haltepipette, was eine tiefe Furche in die Eizelle. Saugen Sie eine sehr kleine Menge von Eizelle Zytoplasma in die Pipette, tragen eine einzelne schwache Piezo-Impuls an die Eizelle Membran zu brechen, werfen Sie die Spender Kern, ziehen Sie die Nadel schnell, während Absaugen an der Cytoplasmamembran am rechten Ende der Furche. Durch die gleichzeitige Zurückziehen der Nadel und das Absaugen, sollte es möglich sein, um das Loch hinten von links NT zu schließen. Dieses "Loch Entfernung Technik wird die Anzahl der Eizellen, die während der NT lysieren. Waschen Sie die rekonstruierten Eizellen in KSOM und bringt sie in den Inkubator für 1-3 Stunden.

Oocyte Aktivierung

Bereiten Sie die eine Hälfte eines Tellers mit Tröpfchen von Kalzium frei MCZB und die andere Hälfte mit Tröpfchen von Kalzium frei MCZB zuzüglich 10 mM Sr 2 + und 5 μ g / ml Cytochalasin B zu Polkörper Extrusion zu hemmen. Äquilibrieren für 30 min. unter 5% CO 2 in Luft. Wash NT Embryonen auch in Calcium-freier MCZB und sie dann in kleinen Gruppen in verschiedene Tropfen Calcium-freier MCZB. Bringen Sie die Schüssel in den Inkubator und Kultur für 5-6 Stunden. Zur Kontrolle für die künstliche Aktivierung Protokoll und für Embryokultur Bedingungen sollte nicht entkernte Eizellen eingesetzt werden. Sie werden als parthenogenetischen Embryonen entwickeln. Nach der Aktivierung, waschen Sie die Embryonen durch KSOM Ort und Embryonen im Inkubator für die langfristige Kultur. Vorkerne sichtbar sein soll zu diesem Zeitpunkt, was eine erfolgreiche Übertragung.

Embryo Culture Medien Cookbook

Master-Salze

Beginnen Sie mit 980 mL Reinstwasser H 2 O in sterile 1 L Flasche

Add trockenen Komponenten:

NaCl 4760 mg (81mm) Sigma S-5886
KCl 360 mg (5mm) Sigma P-5405
MgSO 4 • 7 H 2 O 290 mg (1.18mM) Sigma M-2773
KH 2 PO 4 160 mg (1.17mM) Sigma P-5655
EDTA 2NA 40 mg (0,1 mm) Sigma E-6635
Glucose (D) 1000 mg (5,5 mm) Sigma G-6152

Add flüssigen Komponenten

Na-Laktat (Milchsäure) 5,3 mL & nbsp; Sigma 44263
Pen'Strep 10 mL Gibco 15140-122

Für MCZB Lager Salze:

Filter sterilisieren 500 mL Master-Salze (gut für 3-4 Monate; lagern bei 4 ° C)

Für HCZB Lager Salze:

Beginnen Sie mit 500 mL Master-Salze

Dann werden 50 mg PVA (kalt löslich; Sigma P-8136)

Stir für 30-60 min und Sterilfilter (gut für 3 Monate; lagern bei 4 ° C)

Ca + + Kostenloses MCZB (für Eizellen Aktivierung in 5% CO 2)

Beginnen Sie mit 99 mL MCZB Lager Salze

Add trockenen Komponenten:


NaHCO 3 211 mg Sigma S-5761

Na-Pyruvat (Brenztraubensäure) 3 mg Sigma P-4562

L-Glutamin 15mg Sigma G-8540

Rinderserumalbumin (BSA) 500 mg Sigma A-3311

Swirl, bis alle Komponenten gelöst sind; Sterilfilter.

HCZB (für Mikromanipulation in Umgebungsatmosphäre)

Beginnen Sie mit 99 mL HCZB Lager Salze

Add trockenen Komponenten:


Hepes-Na 520 mg Sigma H-3784

NaHCO 3 42 mg Sigma S-5761

Add flüssigen Komponenten:

128 mM CaCl 2 (18.8g / l) 1 mL Sigma C-7902

Der pH-Wert auf 7,5 mit 1 N HCl

Swirl, bis sie gelöst; Sterilfilter.

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Discussion

Viel Glück!

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Acknowledgments

DE möchte Dr. ausblenden Akutsu für die gemeinsame Nutzung seiner NT Tricks und Dr. Stephen Sullivan und Garrett Birkhoff für die kritische Durchsicht des Protokolls zu danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytochalastin B Sigma-Aldrich 100x stock = 500 µg/ml Cytochalasin B in DMSO. Store at -20 ˚C.
Strontium Chloride 10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature.
MCZB Stock Salts Filter sterilize 500 ml master salts (good for 3-4 months; store at 4 ˚C)
HCZB Stock Salts Start with 500 ml master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4 ˚C).
PVA Sigma-Aldrich P-8136 cold-soluble
HCZB with 11% w/v PVP Start with 20 ml HCZB medium in a 50 ml conical tube. Place 22 g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4 ˚C for 72 – 96 hr, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4 ˚C.
PVP ICN Biomedicals MW 360,000
Please check for additional buffers compositions in the Protocol part.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eggan, K., Jaenisch, R. Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches. Pease, S., Lois, C. Springer. (2006).
  2. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo. Press, C. S. H. L. (2003).
  3. Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394, 369-374 (1998).

Comments

6 Comments

  1. I am going to start ICSI in Equine (horese) oocyte and for this from start point I have some problems, in papers which I am going to follow they published that before injection they put 1 microlitter of sperm suspension in 3 microlitter of Sp-TALP containing 10% PVP (SIGMA) . I did the same, but you know 10% PVP (I calculated w/v) is to much powder that's why I found all of the sperm dead before injection. I don't know realy how I have to use this PVP (MW 360000) ?!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2008 - 8:07 AM
  2. Hello - I work at Sigma-Aldrich in St. Louis, Mo. and have received an answer for your question from our technical service group.  It follows below: _____________________________________________________________________________ We really do not have an answer as we do not have an IVF product. We do have the following references however we have not researched them. Some references on this product are as follows: 1. Yamazaki, Y., et al., Reprogramming of primordial germ cells begins before migration into the genital ridge, making these cells inadequate donors for reproductive cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100(²1),, 1²²07-1²²1² (²003). ². Shitara, H., et al., Selective and Continuous Elimination of Mitochondria Microinjected Into Mouse Eggs From Spermatids, but Not From Liver Cells, Occurs Throughout Embryogenesis. Genetics, 156, 1²77-1²84 (²000). 3. Coy, J.F., et al., A complex pattern of evolutionary conservation and alternative polyadenylation within the long 3'-untranslated region of the methyl-CpG-binding protein ² gene (MeCP²) suggests a regulatory role in gene expression. Human Mol. Genet., 8(7), 1²53-1²6² (1999). It is commonly used in Denharts solution at 1% (10mg/ml). For mouse embryo culture, PVP 40 (40,000 mw) is used at 0.5% in the culture media. The PVP360,000 solution is used to immobilize or slow the sperm. You may want to use a 1% solution rather than a 10% solution. _____________________________________________________________________________ We hope that the above is helpful to you. - Diane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 13, 2008 - 4:08 PM
  3. Do clones develop when injected into the body of the mother? ie not in the uterus? perhaps after a sufficient number of cell divisions, growth factors... has anyone tried? a little like conjointed twins. no be immune rejection if it dŒs, this could perhaps then allow to grow new members only, as happens often with conjointed twins. the new members would be fully young.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 29, 2008 - 6:00 PM
  4. terrific, and very instructive. Thanks a lot. Yunhai from China.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 25, 2008 - 3:40 AM


  5. Thanks a lot.

    YongWei from China.

    Reply
    Posted by: yongwei N.
    April 17, 2013 - 5:10 AM
  6. Hello,
    I'm a PhD student form Universitat Autònoma de Barcelona. The main tool of my studies is SCNT. I would like to contact with Dieter Egli and Kevin Eggan if it's possible, because i need some advices about the transfer of electrical impulse through the micropippete.
    Few months ago i used to use PVP 3% for cummulus cells, but i realised that PVP 10% was better for incresase the number of 2 cell embryos. Nowadays the problem is the transmition of piezzo. How much increases the PVP concentration, more difficult is the transmition of the electrical impulse across the micropippete. I've tried to increase the frequency, amplitude and duration of the electrical PiezoDrill, but at the moment is still too much difficult to breack the Zona pellucida.
    I'm sure that you will have some advices or an answer for this problem.
    Thank you.

    Reply
    Posted by: Laia P.
    December 22, 2014 - 1:27 PM

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